響應面法優化中藥復方中總黃酮提取工藝及藥理作用研究

王婭玲 陶然 宋興爽

摘 ? ? ?要：目的：探索中藥復方中黃酮最佳工藝，研究各因素對其抗氧化能力的影響差異。以中藥復方為實驗材料進行響應面優化實驗，并測定黃酮的抗氧化能力。經響應面實驗證實提取復方中黃酮的最佳工藝為回流溫度84 ℃、回流時間2 h、料液比1∶30 mg·mL-1，此時黃酮的占比為4.51%。體外藥理實驗表明：DPPH清除率為85.66%，纖體復方中總還原力為0.89 Abs，為抗壞血酸的0.67倍，該復方具有顯著的抗氧化活性。

關 ?鍵 ?詞：總黃酮含量;響應面優化;中藥降血脂

中圖分類號：TQ 041 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）05-0830-04

Abstract： Objective： to explore the optimum technology of flavonoids in TCM and to study the difference of antioxidant activity among different factors. Response Surface Methodology （RSM） was used to optimize the antioxidant activity of flavonoids. Response surface experiments confirmed that the optimal extraction process of flavonoids in the compound was reflux temperature 84 ℃， reflux time 2 h， feed/liquid ratio 1∶30 mg·mL-1， and the proportion of flavonoids was 4.51%. In vitro pharmacological experiments showed that the scavenging rate of DPPH free radical was 85.66%， and the total reducing power of the compound was 0.89 Abs， 0.67 times that of ascorbic acid.

Key words： ?Total flavonoid content; Response surface optimization; Chinese medicine forlowering blood lipids

根據衛生部官方統計，我國高血脂發生率高達25%，并且有日益廣泛化的趨勢。高血脂癥不僅受遺傳因素的影響，與后期的生活習慣、飲食健康、起居睡眠等息息相關。高血脂癥可紊亂脂質代謝，引發多種慢性疾病，影響生命質量[1]。體內脂質排泄異常，可引起血管硬化，間接誘發供血不足甚至心肌梗塞[2]。

近年來，國外常用降脂藥多以人工合成為主，副作用顯著，臨床驗證其見效快但易傷脾胃，所以中藥降血脂愈來愈受到人們的喜愛[3，4]。高血脂癥可導致肝失疏泄、脾胃失調、氣虛血弱[5]，決明子、荷葉、薏仁等中藥經研究都具有較好的降血脂功效。本實驗旨在研究實驗室研究自制降脂復方清除自由基能力和抗氧化活性，以期為制備降血脂新藥提供實驗基礎。

陳俊其[6]等優選三種不同溶劑提取黃酮，結果表明黃酮在乙醇中溶解最充分，因此本次提取溶劑選用乙醇。黃酮在高溫下因結構不穩定而分解，降低溶出率[7]，本實驗采用超聲波輔助乙醇加熱回流的方法，可加快提取進程，增大溶解度。

本次實驗以中藥復方中黃酮得率為目的，設計響應面實驗，研究回流時間、回流溫度、料液比對最終實驗的影響[8]，測定抗氧化活性。

1 ?試劑與器材

DPPH、亞硝酸鈉、蘆丁對照品[9];離心機、雙頻恒溫數控超聲波清洗器、旋轉蒸發儀、恒溫水浴鍋等[10]。

2 ?實驗部分

2.1 ?含量測定

2.1.1 ?蘆丁標曲

按照規定方法繪制標準曲線。回歸方程 y=0.502 9x+0.007 5，R2=0.998 3，R2>0.998表明所得方程具有可行性和線性關系。

2.1.2 總黃酮含量測定

量取30 mL新配制的80%乙醇溶液倒入1.00 g中藥粉末，密封超聲20 min，加熱回流，分離上清液，定容稀釋，低溫密封保存。移液槍吸取1 mL，測定其吸光度[11]。

2.1.3 ?單因素實驗

同上述黃酮測定方法，測定吸光度值，生成趨勢表，最高點所對應的水平即為該因素的最佳工藝。

2.1.4 ?響應面實驗

分析3個自變量的改變對響應值作用的規律，在單因素實驗的數據分析上，設計響應面優化選取最佳提取組合[12]，見表1。

2.2 ?抗氧化能力測定

2.2.1 ?DPPH自由基清除率

配制DPPH儲配液，避光冷藏保存。參照下表加樣進行實驗，結合空白組，計算DPPH清除率[13]。

2.2.2 ?總還原力

根據最新版藥典標準方法測定總還原力[14]，測定700 nm下稀釋溶液的吸光度，同時以不同梯度的Vc作陽性對照，評價中藥復方中黃酮的氧化還原能力。

3 ?實驗結果

3.1 ?響應面實驗

以復方黃酮得率為目的，根據回歸模型，得到總黃酮得率Y與3個變量間的線性關系：Y=45.06-0.98A+1.62B+4.69C+0.74AB+1.57AC-2.25BC-6.38A2-5.03B2-1.73C2，見表3。

分析ANVOA結果，A（料液比）、B（回流溫度）作用于實驗結果比C（回流時間）明顯;F值=9.82，P值<0.05， 表明黃酮得率與各考察結果之間密切相關[15]，實驗結果可靠;根據R2=0.876 3， Radj2=0.913 0，即實驗結果幾乎不受誤差影響16]，該回歸模型的建立較為可靠。F值可表示各變量與實驗結果之間的關系密切程度，依次為C>B>A[17]。

3.2 ?響應面交互作用分析

響應面分析圖可用于確定最佳工藝參數，曲面彎曲程度與該因素對實驗結果的敏感程度相關[18]。由圖1可知，保持回流溫度80 ℃，黃酮浸出物量會隨著回流時間延長而顯著變多，在所選范圍內，存在最大值[19]。

根據圖2，響應面相對較傾斜，等高線排列相對不緊密，因此回流溫度和料液比對實驗結果主要是由其共同作用引起，與回歸模型分析結果一致，最高點即為固定回流時間不變只考慮溫度和料液比影響時總黃酮得率的最大值[20];料液比曲面比回流溫度曲面更為傾斜，更占優勢[21]。

根據圖3，響應面起伏坡度較大，等高線彎曲程度較大，推斷回流時間和料液比對黃酮測定作用較大，交互作用較小，與方差分析吻合;固定回流溫度，隨著提取溶劑的增多，更有利于黃酮的溶解，達到飽和后黃酮類物質不再浸出，時間延長致使黃酮分解，蛋白和多糖類物質從細胞中流出，導致提取的溶液中雜質過多[22]。

3.3 ?抗氧化實驗

3.3.1 ?自由基清除率

溶有DPPH的乙醇溶液極易揮發，需低溫冷藏，保存時間不宜過長。該法測定需要考慮諸多因素，不適用于精細測定。

如圖4所示，當藥液濃度較小時，提取液和抗壞血酸對體內自由基的影響較小;藥液濃度較大時，自由基大部分被清除，增勢緩慢，當藥液濃度為達到測定最大值時，黃酮提取液85.66%的自由基遭到破壞，抗壞血酸為90.33%，抗壞血酸對體內自由基的破壞性強于復方總黃酮提取液[23]。

3.3.2 ?總還原力測定（見圖5）

當質量濃度為0.50 mg·mL-1時，該復方中黃酮總還原力為0.89 Abs，抗壞血酸為1.33 Abs，總還原力可反映抗氧化水平，因此該纖體復方的抗氧化性弱于抗壞血酸。

4 ?結 論

含有黃酮類成分較多的物質為天然的還原

劑[24]，許多藥物的有效成分均為黃酮類物質。因此本實驗對中藥復方中的黃酮進行優化采用的方法為乙醇回流法，黃酮類物質極性較大，醇類溶劑有利于黃酮的溶解。

最佳工藝為回流時間2 h、回流溫度84 ℃、料液比1∶30 mg·mL-1，此時中藥復方中總黃酮含量為4.51%[25]。當藥液濃度為0.50 mg·mL-1，復方中總還原力約0.89 Abs，黃酮提取液85.66 %的自由基遭到破壞，還原力為抗壞血酸的0.67倍，具有顯著的抗氧化能力，為降脂復方在食物、保健品和抗氧化劑等方面開發利用擴大市場。

參考文獻：

[1]盧錕剛.決明子、丹參、苦丁茶、股絞藍不同組分配伍降血脂作用研究[D].武漢：湖北中醫藥大學，2013.

[2]崔英，眭建. 維持性血液透析患者并發心腦血管疾病的危險因素研究[J].中國中西醫結合腎病雜志，2016，17（11）：1006-1007.

[3]孫勝亮.柚皮活性成分提取分離及在降血脂方面研究[D].重慶：西南大學，2011.

[4]樂智勇.澤瀉湯降血脂作用機理研究[D].武漢：湖北中醫藥大學，2012.

[5]胡書云，韓冰，王金玲.中藥湯劑在治療高血脂癥中的應用效果評估[J].四川中醫，2019，37（6）：219-221.

[6]陳俊其，秦華珍，尹優，等.山姜屬中藥黃酮類成分提取及分離富集方法研究進展[J].中醫學報，2019，34（11）：2303-2307.

[7]滕晶.基于系統辨證脈學構建氣變特色脈診診斷體系[J].山東中醫雜志，2018，37（3）：181-183.

[8]陳健初. 水芹黃酮類成分分離鑒定和生物活性研究[D].杭州：浙江大學，2014.

[9]宋怡偉，趙志剛，韓成云，等.響應面法超聲輔助提取香椿葉總黃酮及抑菌效果研究[J].食品研究與開發，2019，40（23）：153-158.

[10]陶然，劉金虎，毛會秀，等.基于半仿生酶解技術的中藥烏賊墨最佳用酶初步篩選[J].當代化工，2019，48（4）：738-741.

[11]曹廣超，王舒玉，王彥多，等.正交試驗法優選發酵蜣螂粉中總黃酮的提取工藝[J].華西藥學雜志，2018，33（3）：305-308.

[12]張鵬，張蝶，唐森，等.羊蹄甲果莢總黃酮提取工藝優化及抗氧化性研究[J].當代化工，2019，48（12）：2717-2722+2726.

[13]吳儀君，劉小芳，李萬忠，等.白花蛇舌草不同極性部位抗血管生成及抗氧化活性研究[J].中醫藥導報，2018，24（17）：50-54.

[14]單康. 河蜆多肽抗氧化活性及對急性化學性肝損傷的保護作用[D].揚州：揚州大學，2016.

[15]黃平，毛坤軍，金賢武，等.響應面法優化山蠟梅葉顆粒總黃酮提取工藝[J].中國現代中藥，2019，21（12）：1688-1692.

[16]邱相坡，梁璇，王文斌，等. 基于響應面法的連翹果實總黃酮閃式提取工藝優化[J].山西農業科學，2020，48（03）：452-457.

[17]易永，饒志為，胡鋒平，等. 響應面法優化Na2S2O8/H2O2處理垃圾滲濾液生化尾水[J].工業水處理，2018，38（08）：33-37.

[18]王立娜，王穎，邢佰穎，等.響應面法優化土鱉蟲水溶性蛋白質的提取條件[J].食品與藥品，2017，19（1）：26-29.

[19]賈洪信.香菜黃酮的提取優化及抗氧化活性的初步研究[J].中國調味品，2018，43（04）：79-84.

[20]郝可欣，胡文忠，張清潔，等.響應面法優化超聲輔助提取代代花總黃酮的工藝及其抗氧化活性研究[J].食品工業科技，2019，40（24）：159-164+171.

[21]劉淑霞，郭永霞，魏國江，等. 響應面法優化火麻籽蛋白質的提取工藝[J].中國麻業科學，2017，39（01）：37-43.

[22]秦國正，琚勇，張明芮，等.響應面法優化黑根霉胞外多糖脫蛋白工藝研究[J].天然產物研究與開發，2017，29（10）：1773-1778+1784.

[23]吉惠杰，程振玉，薛俊禮，等.仙人草總黃酮提取工藝優化及抗氧化活性研究[J].中國食品添加劑，2016，（12）：133-138.

[24]楊楠，賈曉斌，張振海，等.黃酮類化合物抗腫瘤活性及機制研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（3）：373-381.

[25]孫艷，楊志偉.火龍果總黃酮提取工藝優化[J].南方農業學報，2016，47（06）：1001-1008.