穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠血清NO及子宮組織VEGF/KDR表達(dá)的影響?

萬荷天一，陳 睿，唐也笑，羅小光△

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550004； 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽 550004)

《素問·調(diào)經(jīng)論篇》指出，五臟之道皆出于經(jīng)隧以行血氣血氣不和百病乃變化而生，表明氣血不和、氣滯血瘀是百病的根源。由于女性自身的生理特點，氣滯血瘀可以作為對女性疾病病理變化整體反應(yīng)的概括，也是婦科辨證論治的重要依據(jù)。瘀血阻滯沖任、胞宮，則可導(dǎo)致經(jīng)帶胎產(chǎn)雜諸多疾病，常常包括月經(jīng)病、產(chǎn)后病、不孕癥、更年期綜合征等婦科疾病、損美性疾病如黃褐斑、痤瘡等，及相關(guān)并發(fā)癥如高血壓、糖尿病、心血管疾病、肥胖等疾病。近年來，女性的發(fā)病年齡從青春期到絕經(jīng)期不等，嚴(yán)重影響女性的身心健康和生活質(zhì)量。基于前期課題對女性疾病的研究表明[1-2]，丹紅穴位注射、桃紅四物湯都能改善氣滯血瘀證大鼠血液流變學(xué)狀態(tài)，顯示出明顯的活血化瘀作用，但丹紅穴位注射、桃紅四物湯對氣滯血瘀證雌性大鼠是否具有祛瘀生新的作用，以及其作用機制是否與調(diào)節(jié)祛瘀相關(guān)的血管活性物質(zhì)血清一氧化氮(NO)和血管新生相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)/血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)相關(guān)，筆者尚未見報道。故本課題組通過觀察穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠血清NO、子宮組織VEGF/KDR mRNA及蛋白的表達(dá)，探究丹紅穴位注射可否促進(jìn)血清NO、子宮組織VEGF/KDR表達(dá)，以達(dá)到“祛瘀生新”的作用，為臨床用于氣滯血瘀證各類女性疾病提供新的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雌性SD大鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量250～270 g，由長沙市天勤生物動物實驗中心提供(實驗動物許可證號SCXK(湘)2014-0010)。大鼠置于安靜、清潔的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，室溫(23±1)℃、濕度(65±5)%、晝夜12 h交替環(huán)境，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、中藥組、穴位注射組每組各10只。本實驗已通過貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心實驗動物倫理委員會審查。

1.2 主要試劑及儀器

鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司)；NO試劑盒(南京建成科技有限公司)；VEGF兔多克隆抗體(bs-1313R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；KDR兔多克隆抗體(bs-10412R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Animal Total RNA lsolation Kit、RT EasyTM II(First-strand cDNA synthesis for Real Time PCR)、Real Time PCR EasyTM(均為 FOREGENE公司生產(chǎn))；丹紅注射液20 ml(山東丹紅制藥有限公司)。桃紅四物湯組成：熟地黃24 g，當(dāng)歸12 g，白芍12 g，川芎6 g，桃仁9 g，紅花6 g(貴州醫(yī)科大學(xué))。

轉(zhuǎn)輪式切片機(德國徠卡-2016)；PIKORed 96型實時熒光定量RT-PCR儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)；C2500型低溫離心機(湖南湘儀實驗儀器廠)。

1.3 模型制備方法

參照文獻(xiàn)[3]備制模型。除空白組外，其余3組大鼠連續(xù)18 d左下腹注射腎上腺素(adrenaline,Adr)0.09 mg/kg，每日1次 給藥后4 h接受1種不可預(yù)見性刺激：A夾尾(10 min)；B烘箱熱烘(10 min)；C冰水游泳(0～4 ℃，4 min)；D晝夜顛倒；E 束縛(10 min)；F傾斜(45°仰斜鼠籠2 h)。造模周期為18 d，以上刺激每天給予1種，整個周期中每種刺激分別達(dá)到3次。

1.4 治療方法

造模結(jié)束后24 h開始治療。空白組不做其他任何處理，模型組每日抓捕1次，中藥組根據(jù)臨床人用劑量，按照每公斤體質(zhì)量用藥量的人鼠比例換算，用中藥7.25 g/kg灌胃[4]，每日1次共14次。穴位注射組將大鼠俯臥固定于木板上，根據(jù)華興邦大鼠體穴定位圖[5]提供的定位方法，選雙側(cè)肝俞、膈俞穴進(jìn)行常規(guī)消毒后，注射丹紅注射液0.02 mL/穴，每周2次共4次。

1.5 指標(biāo)檢測

取材：末次治療24 h后心臟取血10 ml，其中3 ml血采集入枸櫞酸鈉采血管中，5 ml血采集入肝素采血管中，均送至貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室做血液流變學(xué)、凝血4項檢測；2 ml血樣本靜置后離心，采用化學(xué)法做血清NO濃度測定。取血后迅速剖腹，摘取子宮用0.9%的氯化鈉溶液沖洗后，置于-80℃低溫冰箱凍存用于q-PCR檢測;稱重后放入福爾馬林液中固定24 h，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，用于免疫組化法檢測。

熒光定量PCR法檢測子宮組織VEGF/KDR mRNA的表達(dá)：Trizol法提取子宮組織總RNA，測定RNA含量和260/280的比值。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個循環(huán)。每樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以2-△△Ct表示樣本中目的基因相對表達(dá)含量。其中β-actin、VEGFA和VEGFR2等引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，并以ULTRAPAGE純化，其基因序列如下。

表1 PCR引物序列

免疫組化法檢測子宮組織VEGF/KDR蛋白的表達(dá)：取固定好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，用3%H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶、微波加復(fù)合蛋白酶修復(fù)暴露抗原，滴加正常兔血清封閉液，室溫20 min滴加稀釋的一抗(1∶50)4℃過夜，滴加生物素化二抗37℃30 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染脫水，透明中性樹脂封片，顯微鏡觀察并計算每張圖像的平均光密度值，檢測各組大鼠子宮組織VEGF/KDR的蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動物行為學(xué)變化

與空白組比較，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡或煩躁不安、易激惹、反應(yīng)遲鈍、舌紫暗、進(jìn)食量少、被毛無光澤、體質(zhì)量減輕等現(xiàn)象；與模型組比較，中藥組和穴位注射組大鼠相對活潑好動，反應(yīng)靈敏。

2.2 穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠血液流變學(xué)的影響

表2示，空白組比較，模型組全血(高、中、低)黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積均顯著升高(P<0.01或P<0.001)；與模型組比較，中藥組和穴位注射組的全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積均顯著降低(P<0.001或P<0.05)，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠血液流變學(xué)的影響

2.3 穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠凝血4項的影響

表3示，與空白組比較，模型組凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)明顯縮短，纖維蛋白原(FIB)含量明顯增加(P<0.01或P<0.001)；與模型組比較，中藥組和穴位注射組TT、APTT明顯延長，F(xiàn)IB含量明顯減少(P<0.05或P<0.01)，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠凝血4項的影響

2.4 穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠血清NO濃度的影響

表4示，與空白組比較，模型組NO顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和穴位注射組NO含量明顯升高，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表4 穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠血清NO濃度的影響

2.5 穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠子宮組織VEGF、KDR蛋白及mRNA表達(dá)的影響

表5圖1示，各組均可見VEGF、KDR蛋白表達(dá)，陽性細(xì)胞呈黃色或棕黃色，VEGF陽性產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，KDR陽性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)。與空白組比較，模型組子宮組織的VEGF、KDR蛋白表達(dá)均降低(P<0.05);與模型組比較,中藥組和穴位注射組子宮組織VEGF、KDR蛋白表達(dá)升高(P<0.05),2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表5示，PCR結(jié)果顯示與空白組比較，模型組VEGF、KDR mRNA均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,中藥組和穴位注射組VEGF、KDR mRNA顯著升高(P<0.05),2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表5 穴位注射對氣滯血瘀證雌性大鼠子宮組織VEGF/KDR蛋白及mRNA表達(dá)的影響

3 討論

本研究復(fù)制氣滯血瘀證大鼠模型發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組全血(高、中、低)黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積均顯著升高，TT、APTT明顯縮短，F(xiàn)IB含量明顯增加，大鼠出現(xiàn)神疲或煩躁、易激惹、淡漠等癥狀，符合適宜于氣滯血瘀證女性疾病特點的雌性大鼠模型[6-7]。

穴位注射療法通過經(jīng)穴-臟腑體系注射給藥，發(fā)揮針、藥、穴的協(xié)同作用，一定程度上會放大藥物的藥理作用[8]。本實驗選擇大鼠的雙側(cè)肝俞、膈俞穴，肝俞是肝之背俞穴，具有疏肝解郁、理氣活血的作用；膈俞為八會穴之血會，具有養(yǎng)血生血、活血化瘀、理氣和營之功效。穴位注射的藥物是丹紅注射液，丹紅注射液是丹參與紅花的復(fù)方提取液。丹參善治血分，祛瘀生新，調(diào)經(jīng)順脈[9]；紅花養(yǎng)血活血、破血通經(jīng)[10]。桃紅四物湯是治療氣滯血瘀證婦科疾病的經(jīng)典名方，其活血化瘀作用已在許多實驗研究中得到證實[11-13]。實驗結(jié)果表明，與模型組比較，穴位注射組與中藥組的全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積均顯著降低，TT、APTT明顯延長，F(xiàn)IB含量明顯減少。穴位注射組和中藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示穴位注射有類似桃紅四物湯活血化瘀的作用。

《醫(yī)方考》云：“新血生則瘀血滑而易去”，祛瘀生新是活血化瘀的高層次,包括活血化瘀以及血管新生兩方面。血管內(nèi)皮細(xì)胞是“祛瘀生新”的主要執(zhí)行者之一，通過釋放信號分子調(diào)節(jié)其血管狀態(tài)，從而達(dá)到“祛瘀新生”的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞是體內(nèi)合成NO的主要細(xì)胞，NO是重要的血管舒張因子，入血液的NO可抑制血小板聚集[14]。因此，血清NO是評價丹紅穴位注射和桃紅四物湯干預(yù)效果的最重要祛瘀指標(biāo)之一。本實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組NO含量顯著下降；與模型組比較，穴位注射組和中藥組NO含量顯著增加，驗證了NO舒張血管功能，提示穴位注射與桃紅四物湯類似，均可以上調(diào)血清NO。然而血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管的形成和血管的功能是由VEGF緊密調(diào)節(jié)的，其受體KDR主要介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，引起血管通透性升高，并有抗細(xì)胞凋亡維持內(nèi)皮細(xì)胞存活效應(yīng)，在血管生成過程中的作用十分重要[15]。VEGF是促進(jìn)血管生成的重要因子，可通過與KDR結(jié)合，激活PI3K/Akt途徑，從而上調(diào)NOS的表達(dá)，誘導(dǎo)釋放出NO；NO也可以通過PI3K/Akt促進(jìn)VEGF/KDR合成，起到正反饋的作用[16]。本實驗研究顯示，與模型組比較，穴位注射組、中藥組均能促進(jìn)子宮組織VEGF/KDR mRNA及蛋白的表達(dá)。穴位注射組與中藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示穴位注射有類似桃紅四物湯的作用，能有效活血化瘀，更能升高血清NO、促進(jìn)子宮VEGF/KDR mRNA及蛋白的表達(dá)，以達(dá)到祛瘀生新的作用。

綜上所述，丹紅穴位注射治療氣滯血瘀證可能的作用機制是血清NO、VEGF、KDR為改善子宮組織血流狀態(tài)最重要因子，三者相互促進(jìn)從而達(dá)到“祛瘀生新”的作用。本研究對氣滯血瘀證的本質(zhì)、祛瘀與生新的關(guān)系、丹紅穴位注射改善氣滯血瘀證的作用機制等方面的研究具有重要意義,為臨床運用丹紅穴位注射治療氣滯血瘀證女性疾病證候提供一定的理論依據(jù)。