基于TCGA胰腺癌數據集識別胰腺癌相關糖尿病特征基因

王新靜 趙昕 張欣雪 曹迪 任章勇 賈利猛 郎韌 賀強

1首都醫科大學附屬北京朝陽醫院肝膽胰脾外科，北京 100020；2北京市海淀醫院普通外科，北京 100080

胰腺癌相關糖尿病(pancreatic cancer-associated diabetes mellitus, PCDM)指胰腺癌(pancreatic cancer, PC)確診前2年內診斷的糖尿病[1]。研究發現，PC患者有68%會新發糖尿病，明顯高于肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌[2]。74%～88%伴有糖尿病的PC患者其糖尿病發生于PC確診之前的2～5年[1,3-4]。由于PCDM與PC的診斷有一定的時間關系，因此如果能夠發現PCDM始動基因，將有利于PC的早期診斷。本研究基于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)-PC數據集mRNA的表達數據，通過生物信息學方法分析PCDM的基因特征，探索PCDM潛在的分子標志物。

資料與方法

一、一般資料與分組

通過TCGA數據庫(http://gdac.broadinstitute.org)下載PC臨床數據和相應的基因組mRNA芯片表達譜數據。臨床病理數據包括185例PC患者的信息，主要有性別、年齡、腫瘤分期、放療、藥物治療、伴隨疾病、復發和預后情況等；基因組mRNA表達譜數據包含其中183例PC腫瘤樣本的20 531個基因的芯片表達數據，所有數據經過Quantile標準化及log2處理。將既往無糖尿病的PC患者歸為PC組(109例)，PC確診前2年內新發糖尿病的患者歸為PCDM組(11例)，排除63例糖尿病病史超過2年的PC患者。

二、基因表達差異分析

采用R軟件“limma”程序包[5]，比較PCDM組與PC組基因表達量的差異，以|log2fold change|>2且P<0.05為標準，篩選差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)并繪制“火山圖”。

三、DEGs的功能富集分析

使用R軟件“clusterProfiler”程序包對DEGs進行功能富集分析，包括基因本體(gene ontology, GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析[6]。其中GO分析包括生物學過程、分子功能、細胞組分分析。

四、構建蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)網絡

通過STRING數據庫(https://string-db.org/)分析PCDM的DEGs相互作用的關系，構建PPI網絡，并通過Cytoscape軟件(3.7.2版本)將結果可視化，最后通過MCODE模塊篩選樞紐基因。

五、統計學分析

采用R軟件(3.5.2版本)整理數據，通過貝葉斯檢驗比較PCDM組與PC組的基因表達量。連續性變量的組間比較采用方差分析，分類變量比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、PCDM組與PC組的臨床病理特征

PCDM組和PC組患者的一般資料及臨床病理特征的差異均無統計學意義(表1)。

表1 胰腺癌相關糖尿病組與胰腺癌組的臨床病理特征比較

二、PCDM的DEGs

與PC組比較,PCDM組有107個DEGs(|log2fold change|>2且P<0.05)，其中47個基因明顯上調，60個基因明顯下調(圖1，表2)。

圖1 胰腺癌相關糖尿病差異表達基因的火山圖

表2 胰腺癌相關糖尿病差異表達基因

三、PCDM 107個DEGs的功能富集分析

對107個PCDM DEGs的GO功能分析發現，在生物學功能方面，基因的主要功能為正向調節細胞分泌和維持細胞鈣離子的穩態(圖2A)；在細胞組分方面，基因的主要功能與小泡腔、細胞質微管腔和細胞外基質成分相關(圖2B)；在分子功能方面，基因主要參與受體活性調節及碳水化合物的結合(圖2C)。KEGG通路富集分析顯示，107個DEGs主要參與細胞因子、受體間相互作用，病毒蛋白與細胞因子受體的相互作用及趨化因子信號等通路(圖2D)。

圖2 胰腺癌相關糖尿病差異基因功能及通路富集分析

四、PCDM 107個DEGs的PPI網絡分析及樞紐基因

通過STRING數據庫，基于107個PCDM的DEGs構建了PPI網絡；通過MCODE模塊識別了5個樞紐基因，分別為GNG8、CNR2、GALR2、CXCL13、NPY2R(圖3)。

圖3 胰腺癌相關糖尿病特征基因蛋白相互作用網絡

討 論

胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤，5年生存率僅8%[7]。發病隱匿、缺少特異性標志物、易早期轉移是導致胰腺癌預后不良的主要原因，因此探索胰腺癌早期始動基因和相關機制對于早期診斷、提高生存率有重要意義。糖尿病與胰腺癌相互影響、互為因果、關系密切[8]。研究顯示糖尿病是胰腺癌的危險因素。Lu等[9]對新發2型糖尿病患者隨訪發現，糖尿病患者罹患胰腺癌風險高于非糖尿病患者；在糖尿病診斷5年內隨訪，第1年的胰腺癌發病率最高。同健康人群相比，新發糖尿病患者罹患胰腺癌的概率提高了8倍，特別是PCDM的患者大部分是在胰腺癌診斷數年前被診斷糖尿病[8]。因此推測新發糖尿病可能是胰腺癌早期臨床表現之一[10]。

鑒別新發糖尿病尤其是PCDM，對于胰腺癌的早期診治具有重要的臨床意義[11]。對新發糖尿病患者進行PCDM的篩查是診斷無癥狀胰腺癌和提高胰腺癌患者生存率的重要手段之一[12]。Illes等[13]定期隨診115例新發2型糖尿病患者，進行CA19-9檢測和超聲檢查，必要時CT檢查，結果顯示其中10例CA19-9升高，但未發現胰腺癌，而3例CA19-9正常的隨訪者被確診為胰腺癌，可見CA19-9不宜作為PCDM的分子標志物。PCDM可能與腫瘤所致胰島素抵抗、癌組織釋放過多的細胞因子和胰島淀粉多肽、自身免疫紊亂、腫瘤細胞破壞胰島等因素有關[14]。因此通過探索PCDM的特征性基因，以此為出發點尋找潛在的分子標志物可能為胰腺癌的早期診斷提供新的思路。

近年來，TCGA數據庫不僅提供了人體常見腫瘤的基因組、轉錄組和蛋白質組等多組學數據，還公布了臨床病理數據及長期隨訪數據，是研究基因與腫瘤表型關系的寶貴資源。基于此，本研究借助TCGA-PC數據集，將患者分為PCDM組和PC組，結果顯示兩組在臨床病理特征方面無明顯差異，在107個DEGs中，GNG8、CNR2、GALR2、CXCL13、NPY2R可能是PCDM的特征性基因。

CNR2是大麻素CB2受體基因，與胰島素分泌相關。研究顯示，CB2受體在胰島β細胞表達；在人胰島細胞灌注實驗中，CB2受體激動劑可通過開放鈣離子通道，促進β細胞分泌胰島素[15]。此外CNR2的激活還可以通過EGF/EGFR和IGF-I/IGF-IR通路抑制乳腺癌的侵襲轉移[16]。本研究結果顯示PCDM組CNR2表達明顯下調，可能與胰島素分泌不足及抑癌作用受損有關。

GALR2為2型Galanin受體，是一種抗糖尿病和抗炎神經肽。文獻提示中樞神經系統中GALR2可以促進糖代謝，其高表達可以抑制胰島素抵抗，避免血糖升高[17]。實驗研究結果顯示激活GALR2可減輕肥胖小鼠骨骼肌的胰島素抵抗[18]。本研究結果顯示，PCDM組GALR2作為樞紐基因表達明顯下調，提示該基因表達下調有可能引起胰腺癌相關糖尿病的發生。此外，實驗研究發現，在裸鼠-人頭頸癌細胞皮下成瘤模型中，GALR2通過p38-MAPK信號通路介導促血管生成細胞因子、VEGF和IL-6的分泌，誘導血管生成，導致頭頸部鱗狀細胞癌侵襲性生長[19]；在涎腺導管癌，GALR2處于高甲基化狀態，與預后不良相關[20]；Galanin蛋白作為一種腫瘤抑制蛋白，在胃癌發揮抑制腫瘤生長的作用[21]。但GALR2在胰腺癌的作用尚無報道，具體作用機制尚需進一步實驗證實。

CXCLl3在人體肝臟、血清和淋巴結均有表達，具有吸附B細胞的能力，被稱為B細胞吸附因子。在正常小鼠胰島中CXCL13過表達，可通過吸附淋巴細胞，形成異位淋巴結。研究發現，外周淋巴組織如脾、淋巴結功能的維持均需要CXCLl3的參與。此外胰島β細胞的形成也依賴于CXCLl3的正常表達，如在非肥胖型糖尿病小鼠注射CXCLl3趨化因子，可阻斷糖尿病進展[22]。鱗狀細胞癌和乳腺癌組織中CXCL13作為一種趨化因子具有招募免疫細胞、抑制腫瘤生長的作用[23-24]。本研究顯示PCDM組CXCL13明顯下調，提示CXCL13可能參與胰腺癌新發糖尿病的發生，并在胰腺癌發生發展過程中發揮一定的作用。

NPY2R為男性糖尿病患者的神經肽Y受體2[25]，其高表達與糖尿病及其并發癥的進展相關，如在1型糖尿病患者隊列研究中，NPY2R可能與嚴重糖尿病導致的視網膜病變有關[26]。也有研究顯示，NPY2R在伴有糖尿病的心臟病患者的右心房肌肉組織中表達明顯降低,可能與器官特異性有關[27]。此外，NPY2R還參與了某些腫瘤的發生過程[28]，如在口腔癌患者中，NPY2R啟動子甲基化更容易引起腫瘤復發[29]；在復發或轉移的乳腺癌患者中，NPY2R的TT基因型頻率明顯增高[30]。可見，NPY2R與糖尿病及腫瘤均相關，但在胰腺癌的作用機制尚需進一步驗證。

本研究由于受TCGA-PC數據集中病例樣本的限制，無法將正常胰腺與糖尿病患者的胰腺組織進行對比，影響了結果的特異性。PCDM組樣本偏少也影響了結果的可信度，因此擴大樣本量，收集適宜的胰腺組織樣本，再進行轉錄組分析有可能揭示PCDM的始動因素，進而為胰腺癌的早期診斷篩選可靠的新型分子標志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突