CRISPR/Cas9技術的研究進展及其在肺癌研究中的應用

朱奕騁

真核細胞基因組包含數十億個DNA 堿基，其編輯十分困難。對基因組進行操作的技術突破之一，是通過同源重組（HR）進行基因靶向的開發。HR 介導的靶向技術通過操縱生殖系感受態干細胞，促進了敲入和敲除動物模型的產生，從而極大地推動了生物學研究的許多領域的發展。

基于核酸酶的基因編輯技術十分有潛力。其中的CRISPR/Cas9 技術，幾乎可以靶向任何基因，且操作較為簡便，敲除效率較高。本文簡介了CRISPR/Cas9 技術的原理及其研究進展，并討論了其在肺癌研究中的應用。

1 CRISPR/Cas9 技術概述

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）是一種較為新穎的基因編輯技術，在科研領域及醫療領域有著十分廣泛的應用。

1.1 CRISPR/Cas9 技術的產生背景

CRISPR/Cas9 技術可能是基因編輯領域近10 年來最偉大的成果之一。1987 年，日本的科學家發現了微生物中的串聯間隔重復序列，但他們的報道并沒有引起科學界的重視。

2002 年，Jansen 等這種序列其命名為CRISPR。此外，研究表明，局部DNA 雙鏈斷裂（DSB）可以觸發易出錯的非同源末端連接（NHEJ）修復途徑。這些早期的基因組編輯研究，讓DSB 誘導的HR 和NHEJ 成為真核生物基因組修飾的重要方法[1]。

2005 年，在科學家對分隔單個直接重復序列的間隔子序列進行分析的時候，他們發現，這些序列可能與噬菌體相關。他們推測，CRISPR 可能與微生物的免疫記憶和防御機制相關，不過，科學家仍未弄清，間隔子是如何發揮作用的。他們提出了一些假設，認為CRISPR 間隔子可能充當小RNA 向導，以降解的病毒轉錄物[2]。

2008 年，科學家又發現細菌CRISPR 系統能阻止外源DNA 的入侵，并驗證了其功能[3]。

可以說，CRISPR 的發展主要經歷了以下階段（圖1）：

圖1 CRISPR-Cas9 基因編輯技術的發展階段

1.2 CRISPR 系統

CRISPR 系統包括一系列Cas 蛋白，這些蛋白可以協助CRISPR 系統，使其更好地發揮免疫作用。在噬菌體入侵細菌時，Cas 蛋白將其識別，并整合到宿主的基因組上。在噬菌體第二次入侵時，CRISPR系統可以準確地識別外源噬菌體，并利用Cas 蛋白的內切酶活性切斷其DNA，使外源噬菌體失去毒力（圖2）。

圖2 CRISPR-Cas9技術的操作示意圖

1.3 CRISPR/Cas9 技術的應用

利用基因工程技術，我們可以改變細胞的遺傳和表觀遺傳特征，從而開展基礎生物學研究和醫學研究。利用基因編輯技術，我們可以在動物或細胞模型中快速有效地誘導變異，從而改變其動物或細胞的功能。基因編輯也會促進有用的合成材料的生產，例如，硅基硅藻可以用于遞送口服藥物。此外，對農作物進行精確的基因編輯，可以提高其或病原體感染的抗性，提高食品的安全性。在醫藥領域，基因編輯可以彌補體細胞中的遺傳或表觀遺傳缺陷，根治遺傳病，這就是基因手術。最后，運用基因編輯技術改造細胞，可以讓細菌高效地生產藥物前體，顯著降低治療的成本[4]。

CRISPR/Cas9 技術在腫瘤的治療中扮演著重要的角色。與其他腫瘤相比，肺癌的發病率和死亡率十分驚人。利用CRISPR/Cas9 技術，我們可以研究某些基因在肺癌的發生中的作用（圖3），助力肺癌的診斷與治療。

圖3 CRISPR/Cas9技術治療肺癌的流程圖

2 CRISPR/Cas9 技術的原理

CRISPR/Cas9 技術的基本原理是，改造天然的Cas 蛋白，從而構建一個更穩定的核酸內切酶，讓它在特定位置切斷雙鏈DNA，在DNA的修復的過程中，基因會發生突變，利用這個過程，科學家可以對基因進行定點改造。

在運用CRISPR/Cas9 技術對基因進行編輯時，必須首先將Cas9 核酸酶蛋白和gRNA 輸送到靶細胞中。這通常是通過向受體細胞中轉染表達DNA 的質粒來實現的，但我們也可以通過遞送RNA 達到這一目的。gRNA 會將Cas9 引導至與gRNA 中的“間隔”序列匹配的靶DNA“原間隔子”序列處[5]。在原間隔子的旁邊，通常存在一段原間隔物相鄰基序（PAM），對于最常用的Cas9 蛋白，這段序列為NGG。如果間隔子和原間隔子相同，或在間隔子的5'末端僅有幾個錯配，Cas9 將切割兩條DNA 鏈，造成雙鏈斷裂（圖4）。

圖4 CRISPR/Cas9技術的原理

3 CRISPR/Cas9 技術的研究進展

CRISPR 系統由sgRNA 和Cas 蛋白組成。在sgRNA 的指導下，Cas 蛋白定位到基因組的目標位置，從而實現精確的遺傳修飾。修復DSB 的DNA 修復機制有兩種高度保守的途徑：NHEJ 和HR。NHEJ 是易于出錯的修復機制，因為修復后的DNA 通常在靶位點周圍有一個小的插入缺失，從而導致基因破壞。因此，我們通常利用NHEJ 使致病基因失活，改變其表達水平。相反，HR 是一種特定的DNA 修復機制，在存在修復模板的情況下，HR 將糾正基因突變或幫助我們插入合成序列。目前，CRISPR/Cas 系統已用于基因敲除、基因突變、轉錄激活和基因篩選等[6]。

許多科學家致力于對脫靶效應的研究，他們嘗試改進Cas9，從而減少脫靶事件的發生。一些研究人員發現，產生單鏈斷裂（SSB）可能是一種有效的方式。由于DNA 單鏈斷裂是通過高保真堿基切除修復（BER）途徑修復的，Cas9 切口酶可用于更特異性的NHEJ 和HR。

為了提高靶標DSB 的特異性，可以使用類似于二聚ZFN 或TALEN 的雙切口法，來增加在靶DNA 中特異性識別的堿基總數。除雙切口策略外，被人為截短的sgRNA，也會顯著提高SpCas9 的靶向特異性，這可能是因為它們對錯配更加敏感。我們可以在使用多重切口策略的同時應用這些截短的sgRNA，以進一步降低脫靶的概率。

4 CRISPR/Cas9 技術在肺癌研究中的應用

在過去的幾十年中，基因療法是癌癥研究中最熱門的領域之一。這是因為，癌癥的發生與進展，與遺傳有著密切的關系。與傳統的治療方法相比，基因療法可以更徹底地治療癌癥，而且其副作用很小。使用CRISPR/Cas9 系統對內源基因座進行靶向修飾，可以克服傳統方法的局限性。這一技術的不斷成熟，使研究人員能夠進一步探索癌癥研究中的未知領域，為無數腫瘤患者帶來了福音。

4.1 CRISPR/Cas9 技術在構建肺癌動物模型中的應用

構建肺癌動物模型一直是一項艱巨的任務，與CRISPR 相關的新技術浪潮，使研究人員能夠構建更多滿足研究需要的動物模型。將一些抑癌基因敲除，可能有助于構建在功能和結構上類似于天然腫瘤的肺癌動物模型。利用CRISPR/Cas9 技術，可以高效地敲除感興趣的基因，從而構建相關的動物模型。一些科學家應用CRISPR/Cas9 技術敲除了3 種主要的腫瘤抑制基因TRP53、PTEN 和VHL，成功地構建了肺癌模型。在對某些肺癌相關基因的研究過程中，我們也可以將CRISPR/Cas9 技術與其他基因編輯技術結合使用[7]。

4.2 CRISPR/Cas9 技術在肺癌治療中的應用

迄今為止，全世界有13 項將CRISPR 作為癌癥治療的干預手段的臨床試驗（來源：clinicaltrials.gov）。在離體基因編輯研究中，可以通過敲除T 淋巴細胞中某些降低其靶向效率的基因，來提高T 細胞的有效性；也可以將癌細胞抗原特異的嵌合抗原受體連接到T 淋巴細胞表面，以增加其靶向特異性，從而提高其靶向效率。

到目前為止，CRISPR/Cas9 技術作為肺癌的干預手段，僅在一項臨床試驗中得以實施。該試驗目前正在四川大學進行。在這項試驗中，研究人員評估PD-1 基因敲除的T 細胞治療轉移性非小細胞肺癌的安全性（試驗編號：NCT02793856）。這項研究的基礎是PD-1 基因的功能，PD-1 基因是一種促進程序性細胞死亡的基因，已被證明僅在活化的T 細胞中表達，并作為免疫檢查點。因此，敲除PD-1基因將延長T 細胞的壽命，并通過破壞T 細胞周期檢查點抑制劑來防止活化的T 細胞死亡。這將增加血液中活化的T 細胞計數，從而抑制腫瘤的進展。在上述研究中，研究人員從外周血中收集自體來源的T 細胞，并使用CRISPR/Cas9 系統特異性地敲除PD-1 基因。實現這一目標后，研究人員將進一步擴增并選擇自體來源的PD-1 基因敲除的T 淋巴細胞。將這些T 細胞分批回輸體內后，研究人員將評估治療效果[8]。

5 結語

基于基因療法的技術有可能在癌癥研究中帶來突破，而CRISPR 是一種非常有針對性和有效的工具，有潛力將其轉化為可用的療法。事實證明，與ZFN 和TALENs 等其他著名的基因治療技術相比，CRISPR 具有許多優勢。雖然現在可用的其他治療方法只是暫時的，隨著時間的流逝會逐漸消失，但是基因治療是遺傳的，可以永久使用，就像將治療方法硬編碼到體內一樣。這具有創造疫苗和永久治愈的潛力。除治療方面的應用外，CRISPR 也是了解我們細胞中代謝反應及信號通路的一種重要工具。我們應當充分利用CRISPR/Cas9 技術，更深入地研究與肺癌相關基因的功能，助力腫瘤治療學的發展。