丹參川芎嗪注射液改善缺血性卒中大鼠Th17/Treg平衡減輕神經(jīng)缺血損傷的研究*

全宏娟

（湖南省郴州市第一人民醫(yī)院神內(nèi)重癥科，郴州 423000）

腦缺血誘發(fā)的中樞免疫炎癥反應(yīng)是卒中重要的病理特征之一。研究顯示，T淋巴細(xì)胞是腦內(nèi)持續(xù)炎癥反應(yīng)發(fā)生的核心[1]。腦缺血后，外周淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞受趨化因子募集，穿過損傷的血腦屏障浸潤至腦組織，引起腦內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答；并和腦內(nèi)固有的免疫細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞一起產(chǎn)生更多的炎性介質(zhì)，惡化神經(jīng)缺血損傷[2]。Th17與Treg細(xì)胞為功能相反的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，Th17促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而Treg抑制炎癥反應(yīng)，二者數(shù)量與功能的平衡是維持自身免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素[3]。已有一些證據(jù)提示Th17和Treg參與了缺血后的腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)過程[4-6]，那些具有抑制Th17而增強Treg細(xì)胞數(shù)量及功能的治療策略，則有助于炎癥環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)。

丹參川芎嗪注射液（DCZ）是臨床治療缺血性卒中的常用藥，主要成分為丹參素與鹽酸川芎嗪，二者協(xié)同起效，具有降低血黏度、擴張腦局部血管，改善腦組織改善微循環(huán)、減輕腦組織水腫、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[7]。目前對丹參川芎嗪注射液對卒中后腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用關(guān)注甚少，且多集中于對炎癥因子水平的改善。因此，本研究擬觀察丹參川芎嗪注射液對卒中后大鼠腦內(nèi)Th17/Treg的影響，以闡明Th17/Treg在卒中后的變化規(guī)律，為臨床使用丹參川芎嗪注射液治療卒中提供更多實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 紅細(xì)胞裂紅液、Percoll細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI Medium 1640培養(yǎng)液購自上海立菲生物技術(shù)有限公司；APC Mouse Anti-Rat CD3、FITC Mouse Anti-Rat CD4、PE Mouse Anti-RatCD25、PE MouseAnti-RatCD8a、Transcription Factor Buffer Set、4 ×Fix/Perm Buffer、Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug購自美國 BD 公司；APC Foxp3、Anti-Rat IL-17A APC 購自美國 eBio science；IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10 的ELISA試劑盒購自德國IBL公司。

1.1.2 主要儀器 臺式高速離心機為德國Eppendorf公司（Centrifuge 5430 R）；流式細(xì)胞儀為美國BD公司（FACS Calibur）；多功能酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices公司（SpectraMax i3）。

1.2 動物分組、造模 動物分組：健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量190～210 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。將大鼠隨機分為假手術(shù)組和大腦中動脈阻塞（MCAO）組。除假手術(shù)組為10只動物，MCAO組在手術(shù)后根據(jù)神經(jīng)功能缺損評分（NSS評分）剔除NSS＜2分的大鼠，剩余大鼠隨機分為模型組和參芎組，每組有24 h、3 d、7 d、14 d 共 4 個時相，每時相各 10 只動物。

造模方法：采用Zea Longa腔內(nèi)線栓法阻滯大鼠右側(cè)大腦中動脈，制作MCAO模型。尼龍線直徑為0.205mm。見參考文獻(xiàn)（Longa ZE.Stroke，1989，20（1）：84-91）。假手術(shù)組僅鈍性分離血管但不結(jié)扎，亦不插線，余處理同MCAO組。

1.3 給藥方法 根據(jù)Meeh-rubner體表面積公式及相關(guān)文獻(xiàn)計算大鼠用藥量[8]：大鼠劑量（mL）=成人日劑量（10 mL）×0.018/0.2 kg=0.9 mL/kg。參芎組于造模后按體質(zhì)量腹腔注射0.9 mL/kg的丹參川芎嗪注射液，每日1次；假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。

1.4 實驗方法

1.4.1 神經(jīng)功能缺損檢測 根據(jù)NSS評分標(biāo)準(zhǔn)，對各組動物的神經(jīng)功能進(jìn)行評分[9]。NSS評分是一種針對運動、感覺、反射和平衡功能的綜合性評價指標(biāo)，分值為0～18分，分值越高表示損傷程度越重。

1.4.2 TTC染色法檢測梗死體積百分比 各組大鼠麻醉后采用0.01M PBS和4%多聚甲醛常規(guī)方法經(jīng)心灌注固定；取腦，-20℃冰凍腦組織20 min后，行冠狀連續(xù)切片，片厚2 mm，共切6片。將切片置于2%的TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液中，37℃避光孵育20 min，后用4%多聚甲醛固定24 h。拍照，以Image Pro-plus 6.0軟件計算腦片總面積及梗死面積，將面積之和乘以厚度（2 mm），得出腦片總體積和梗死體積，由此計算出梗死體積百分比。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)分析Th17、Treg細(xì)胞的比例 治療結(jié)束后，將大鼠麻醉，分離大腦中動脈供血區(qū)的腦組織。將腦組織置于RMPI 1640培養(yǎng)液中，300目不銹鋼篩網(wǎng)上機械法制成單細(xì)胞懸液。懸液中依次加入3 mL 37%和70%的Percoll溶液，500×g離心20 min，分離中間層（單個核細(xì)胞層），洗滌并重懸細(xì)胞。

Treg細(xì)胞抗體標(biāo)記：取腦單細(xì)胞懸液，加入2倍體積的紅細(xì)胞裂解液，4°C孵育15 min，450×g離心10 min，1×PBS 洗滌并重懸細(xì)胞。加入 1.5 μL CD4和 2.5 μL CD25，4℃避光孵育 20 min。1×PBS 洗滌并重懸細(xì)胞。渦旋加入 1 ml 1×Fix/Perm Working Solution破膜，4℃避光孵育 40 min，1× Perm/Wash洗滌并重懸細(xì)胞。加入2.5 μL FoxP3抗體，4℃避光孵育50 min。1×Perm/Wash洗滌并重懸細(xì)胞。加入500 μL 1×PBS溶液重懸細(xì)胞，過300目篩，流式細(xì)胞儀檢測。

Th17細(xì)胞抗體標(biāo)記：取200 μL腦單細(xì)胞懸液，加入 4 μL 刺激液、200 μL RMPI 1640 培養(yǎng)液，37 ℃孵育 4 h。加入各 5 μL CD8a、CD3、CD4 抗體，室溫避光孵育20 min。加入2倍體積的紅細(xì)胞裂解液，4℃孵育 15 min，450×g離心 10 min。加 5 μL IL-17A抗體，4℃避光孵育40 min。1×PBS溶液洗滌并重懸細(xì)胞，過300目篩，流式細(xì)胞儀檢測。

所有樣本經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，并分析樣品中Th17和Treg細(xì)胞的比例。陰性對照不加一抗，以相應(yīng)的同型對照抗體替代。

設(shè)門方案：根據(jù)淋巴細(xì)胞物理性質(zhì)，以前向角、側(cè)向角參數(shù)設(shè)立淋巴細(xì)胞門，根據(jù)淋巴細(xì)胞生物學(xué)特性，利用細(xì)胞表面抗原熒光染色表達(dá)情況設(shè)立CD3+T淋巴細(xì)胞門，再在CD3+T淋巴細(xì)胞中設(shè)立CD4+T淋巴細(xì)胞門，在CD4+T淋巴細(xì)胞門下設(shè)CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞門或CD4+IL17a+Th17細(xì)胞門。

1.4.4 ELISA法檢測炎性細(xì)胞因子水平 依照試劑盒說明書，檢測組織中Th17相關(guān)細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α）；Treg相關(guān)細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示；組間比較采用單因素方差分析；組間多重比較采用LSD法（方差齊）/Dunnett’s T3法（方差不齊）；重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，以分組作為組間因素，不同時間點作為組內(nèi)因素。顯著性差異水平α=0.05，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 對MCAO大鼠NSS評分的影響 造模前，所有實驗大鼠的NSS評分均為0；假手術(shù)組各時間點的NSS評分也為0。模型組24 h的NSS評分最高，其后的時間點逐漸降低，組內(nèi)比較差異顯著（P＜0.01）。參芎組各時間點NSS評分也呈逐漸降低趨勢，組內(nèi)比較差異顯著（P＜0.01）；從第3天開始，與同時間點模型組 NSS 評分差異顯著（P＜0.05，P＜0.01），見表 1。

表1 各組大鼠NSS評分結(jié)果比較（±SD）

表1 各組大鼠NSS評分結(jié)果比較（±SD）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 24 h 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 9.30±1.77**8.10±1.66**6.80±1.41**4.90±1.29**參芎組 10 8.10±1.61 6.90±1.48# 4.90±1.32# 2.80±0.58##

3.2 對MCAO大鼠腦梗死體積的影響 模型組24h的腦梗死體積最大，其后的時間點梗死體積逐漸降低，組內(nèi)比較差異顯著（P＜0.01）。參芎組各時間點梗死體積也逐漸降低，組內(nèi)比較差異顯著（P＜0.01）；且從24 h開始，較同時間點模型組梗死體積明顯縮小，組間比較差異顯著（P＜0.01），見表 2。

3.3 對MCAO大鼠腦內(nèi)Th17、Treg細(xì)胞比例的影響 模型組腦內(nèi)Th17細(xì)胞比例在造模后逐漸升高，于第7 d達(dá)到峰值，而后下降，但至14 d時仍高假手術(shù)組；第3、7、14 d的比例均高于假手術(shù)組，組間比較差異顯著（P＜0.01）。模型組腦內(nèi)Treg細(xì)胞比例在造模后24 h和3 d較假手術(shù)組有所降低，但組間比較無顯著差異；至7 d時，模型組Treg細(xì)胞比例大量增加，與假手術(shù)組相比差異顯著（P＜0.01），見表3，圖 1。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（%,±SD）

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（%,±SD）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 24 h 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 26.82±3.09**25.36±3.84**23.90±3.53**20.89±4.62**參芎組 10 24.74±3.64# 19.14±4.77##16.52±3.90##13.23±3.05##

與模型組相比，參芎組能降低各時間點Th17細(xì)胞比例，且第3、7、14 d的降低幅度較大，與模型組比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；同時，參芎組能提高不同時間點Treg細(xì)胞比例，且第7 d和14 d尤為明顯，與模型組比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01），見表 3，圖 2。

從Th17/Treg比值來看，模型組各時間點Th17/Treg比值均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05，P＜0.01）；而參芎組能降低Th17/Treg比值，與模型組比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）見表 3。

3.4 對MCAO大鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子水平的影響 模型組腦內(nèi)IL-6和TNF-α水平在造模后逐漸升高，于第7 d達(dá)到峰值，而后下降，但至14 d時又高于假手術(shù)組；且各時間點的水平均高于假手術(shù)組，組間比較差異顯著（P＜0.01）。模型組腦內(nèi)IL-4和IL-10水平在造模后較假手術(shù)組有所降低，且IL-4降低更為明顯（P＜0.05）；但各時間點間差異并不顯著。與模型組相比，參芎組能降低各時間點IL-6和TNF-α水平，組間比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；同時參芎組腦內(nèi)IL-4和IL-10水平也有所升高，特別是IL-4升高更為明顯（P＜0.05），見表4。

表3 各組大鼠腦內(nèi)Th17、Treg細(xì)胞的比例（±SD）

表3 各組大鼠腦內(nèi)Th17、Treg細(xì)胞的比例（±SD）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

指標(biāo)24 h 3 d 7 d 14 d組別n假手術(shù)組模型組參芎組假手術(shù)組模型組參芎組假手術(shù)組模型組參芎組Th17（%）Treg（%）Th17/Treg 10 0.75±0.24 0.80±0.26 0.69±0.21 0.69±0.23 10 1.03±0.42 2.15±0.86** 4.75±1.44** 3.42±1.45**10 0.84±0.26 1.63±0.52# 3.27±0.95## 2.10±0.71##10 0.32±0.11 0.32±0.10 0.30±0.14 0.32±0.15 10 0.29±0.084 0.31±0.10 0.48±0.14** 0.51±0.23**10 0.34±0.13 0.40±0.12 0.62±0.18# 0.71±0.25##10 2.31±0.60 2.51±0.59 2.31±0.61 2.16±0.52 10 3.52±1.15* 6.93±1.26** 9.88±2.31** 6.68±2.24**10 2.45±0.63 4.08±1.18# 5.24±1.25## 2.97±1.13##

圖1 腦內(nèi)Th17細(xì)胞比例

4 討論

在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫炎癥反應(yīng)作為導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、壞死的重要原因而貫穿該過程始終。作為細(xì)胞免疫應(yīng)答的主體，T淋巴細(xì)胞是腦內(nèi)持續(xù)炎癥反應(yīng)發(fā)生的核心，而各CD4+T淋巴細(xì)胞亞群則在缺血性腦卒中發(fā)病的免疫學(xué)機制中發(fā)揮著重要作用[1]。

圖2 腦內(nèi)Treg細(xì)胞比例

Th17與Treg細(xì)胞是起源相同、功能相反的CD4+T細(xì)胞亞群。Th17細(xì)胞能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，通過分泌IL-17、IL-6、TNFα等炎癥因子在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[10]。IL-17能誘導(dǎo)IL-6、TNF-α、趨化因子和MMPs等炎癥因子釋放，引起組織浸潤和破壞；還能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟和趨化、刺激T細(xì)胞活化[11]。IL-6、TNF-α等炎癥因子不僅誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的募集和趨化；還能進(jìn)一步促進(jìn)Th17分化并表達(dá)IL-17，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-4等抑制炎癥反應(yīng)，通過控制免疫應(yīng)答的強度，防止過度免疫所致的組織損傷來維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)，F(xiàn)oxp3是其表面特異性標(biāo)志物[12]。Treg不僅直接抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化增殖，還能與效應(yīng)T細(xì)胞競爭性結(jié)合IL-2，從而誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡[13]。Treg還能促進(jìn)TGF-β等抗炎因子分泌來抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性。此外，Treg還能抑制樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能；進(jìn)而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化；Treg還能抑制中性粒細(xì)胞表達(dá)MMP9，從而減少組織損傷[14]。

表4 各組大鼠腦內(nèi)炎癥因子水平（±s）

表4 各組大鼠腦內(nèi)炎癥因子水平（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

指標(biāo)（pg/g）IL-6 24 h 3 d 7 d 14 d 10 289.13±25.56 293.49±39.21 283.76±31.40 301.44±29.79 10 413.28±27.32** 619.40±75.96** 715.71±65.61** 577.20±48.02**10 352.16±31.88# 444.55±62.71## 475.49±33.51## 343.17±34.16##10 62.24±11.71 63.32±11.09 61.19±12.78 65.71± 9.18 10 88.37±14.23* 115.35±12.17** 148.57±15.72** 105.96±13.80**10 75.28± 9.22# 94.23±10.57## 105.82±13.59## 74.81±12.47##10 401.18±38.27 407.65±34.05 405.82±18.59 413.15±27.70 10 366.61±29.23* 341.48±25.84* 331.86±27.56* 352.95±23.23*10 410.26±22.50# 399.96±40.67# 404.48±24.26# 422.75±31.62#10 414.10±38.27 407.15±21.72 422.22±27.19 411.15±23.19 10 401.59±21.81 384.13±25.33 386.65±32.25 393.70±27.56 10 419.91±35.46 417.20±11.92 427.32±29.78 416.56±31.82組別假手術(shù)組模型組參芎組假手術(shù)組模型組參芎組假手術(shù)組模型組參芎組假手術(shù)組模型組參芎組n TNF-α IL-4 IL-10

研究顯示，Th17和Treg通過細(xì)胞因子間的相互作用、轉(zhuǎn)化等參與急性缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展。MCAO小鼠缺血后72 h，可見腦內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量顯著增加，其相關(guān)促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α表達(dá)顯著上升；而Treg細(xì)胞數(shù)量及相關(guān)細(xì)胞因子IL-10未見明顯變化[4]。缺血腦組織表達(dá)IL-17增多；削弱IL-17的功能后，腦缺血面積縮小[5]。腦缺血后，腦內(nèi)Treg數(shù)量明顯增多，腦內(nèi)Treg數(shù)量與缺血面積呈負(fù)相關(guān)；增強Treg功能可減輕腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化；并使缺血面積減小、神經(jīng)功能改善；而去除Treg則阻礙神經(jīng)功能恢復(fù)[15]。靜脈輸注體外擴增的Treg細(xì)胞，可改善腦缺血大鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)[6]。采用低劑量抗原誘導(dǎo)缺血前免疫耐受，可導(dǎo)致Treg功能增強，分泌抗炎因子TGF-β和IL-10增多，從而減輕神經(jīng)缺血損傷[16]。

丹參川芎嗪注射液（DCZ）為丹參素與鹽酸川芎嗪的復(fù)方中藥注射液。丹參素在中藥丹參中含量較高，其水溶性好，易于吸收，能快速透過血腦屏障[17]。丹參素可呈劑量依賴性地抑制血小板聚集，且對凝血酶原時間、纖維蛋白原等凝血四項指標(biāo)無影響，提示丹參素在溶栓方面具有良好的安全性[18]。丹參素還能通過抑制缺血性卒中腦內(nèi)凋亡基因Bax、caspase-3等表達(dá)、降低NF-κB通路活性、降低IL-1β、IL-6和 TNF-α 等炎癥因子水平[19]、減少細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶水平、降低氧化損傷等，改善半暗帶腦區(qū)缺血、缺氧及炎癥反應(yīng)水平，來減少神經(jīng)元存活微環(huán)境，進(jìn)而改善神經(jīng)功能[20]。川芎嗪為中藥川芎的主要活性物質(zhì)，屬生物堿類。川芎嗪是鈣拮抗劑，通過抑制Ca2+內(nèi)流并促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+釋放、提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化水平、提高線粒體生物合成而促進(jìn)有氧代謝，進(jìn)而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能、促進(jìn)血管舒張[21]。川芎嗪可減少MCAO大鼠腦梗死面積、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和軸突形成；還可促進(jìn)體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元分化[22]。川芎嗪可降低血腦屏障通透性、抑制MCAO大鼠腦內(nèi)中性粒細(xì)胞活化[23]、抑制NF-κB通路激活及炎癥因子表達(dá)、激活Nrf2/HO-1通路以減輕缺血引起的氧化損傷、抑制神經(jīng)元型一氧化氮合酶表達(dá)等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[24]。臨床研究顯示，丹參川芎嗪注射液能顯著改善卒中患者神經(jīng)缺損癥狀，并可改善患者血脂、降低血清同型半胱氨酸和高敏C反應(yīng)蛋白水平、提高超氧化物歧化酶活性等[25-26]。

本研究結(jié)果顯示，MCAO大鼠腦缺血后NSS評分明顯增高，腦梗死體積較大。丹參川芎嗪注射液能明顯改善其NSS評分，降低梗死體積。MCAO大鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)快速激活，在缺血后24 h就可見Th17細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平增加；且隨缺血時間延長而進(jìn)一步增長。Th17細(xì)胞比例的這種變化也與NSS評分改變相一致。至缺血后3 d，Treg細(xì)胞比例較假手術(shù)組降低，直至缺血后7 d，Treg細(xì)胞比例方有所上升。而Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平在缺血后7 d仍低于假手術(shù)組，至缺血后14 d，二者水平方有所上升。丹參川芎嗪注射液能降低Th17細(xì)胞比例及IL-6和TNF-α水平；而增加Treg細(xì)胞比例及IL-4和IL-10水平。Th17/Treg比值能較好反映機體炎癥水平，本研究發(fā)現(xiàn)模型組Th17/Treg比值隨時間逐漸升高，至缺血后7 d達(dá)到峰值，而丹參川芎嗪注射液能明顯降低Th17/Treg比值，提示丹參川芎嗪注射液可改善Th17/Treg間的平衡，抑制腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

綜上，腦缺血可快速激活MCAO大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為Th17/Treg比例失衡，促炎因子IL-6和TNF-α水平增加，而抗炎因子IL-4和IL-10水平下降。丹參川芎嗪注射液能調(diào)節(jié)缺血性卒中大鼠Th17/Treg平衡及相關(guān)炎癥因子水平，進(jìn)而改善神經(jīng)元存活微環(huán)境，減輕神經(jīng)缺血損傷。