BRAFV600E基因突變與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關性*

胡斌，馮江龍，沈丹丹，鄧超男**，文靜

(1.貴州醫科大學附屬醫院 病理科，貴州 貴陽 550001；2.貴州醫科大學附屬醫院 超聲中心，貴州 貴陽 550001)

甲狀腺癌被認為是最常見的內分泌惡性腫瘤，近年來發病率呈現逐年上升的趨勢[1]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)是其最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的80%～90%[2]。雖然大部分PTC患者惡性程度不高、預后良好，但仍有近10%患者出現了復發、轉移，表現出極強的侵襲性[3]，因此，甲狀腺乳頭狀癌的早期確診和充分的預后評估顯得尤為重要。有文獻報道BRAFV600E基因突變在甲狀腺惡性腫瘤中多見于PTC，極少見于其他類型惡性腫瘤[4]。BRAFV600E基因突變和PTC的發生、發展及預后相關，是其發生的重要遺傳學改變[5]，但關于BRAFV600E基因突變與PTC各臨床病理特征的相關性仍存在爭論。因此，本研究采用實時熒光定量PCR法對325例PTC患者和50例甲狀腺良性病變患者進行BRAFV600E基因檢測，通過對比分析PTC患者的臨床病理特征是否與BRAFV600E基因突變存在關聯性，探討BRAFV600E基因突變可否作為PTC發生、發展及預后的評判指標，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 選取2019年6—9月病理診斷為PTC的患者325例作為PTC組，同時選取同期病理診斷為甲狀腺良性病變的患者50例作為對照組，均排除術前曾行放化療和/或內分泌治療、有其他惡性腫瘤、有遠處轉移、未行中央區淋巴結清掃及臨床資料缺失者。PTC組患者男性119例、女性206例，年齡16～58歲、中位年齡45歲、≤45歲和>45歲各為177例和148例，腫瘤直徑≤1 cm者279例、>1 cm者46例，單病灶者241例、多病灶者84例，經典型306例、濾泡亞型19例，有淋巴結轉移106例、無淋巴結轉移219例，被膜外侵犯27例、被膜外未侵犯298例，臨床Ⅰ～Ⅱ期318例、Ⅲ～Ⅳ期7例，伴有橋本氏甲狀腺炎105例、未伴橋本氏甲狀腺炎220例。對照組男性18例、女性32例，年齡19～52歲、中位年齡45歲、≤45歲和>45歲各為23例和27例，甲狀腺腺瘤17例、亞急性甲狀腺炎12例及結節性甲狀腺腫21例。取2組患者的病灶石蠟切片作為標本，切片均經常規石蠟切片HE染色，且由2名副高以上病理醫師確認診斷。

1.1.2主要試劑和儀器 FFPE DNA石蠟切片樣品DNA提取試劑盒(批號12220021401x)和人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒(批號11219120301z)均購自中國廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司，二甲苯購自中國重慶江川化工有限公司，乙醇購自中國重慶正元化工有限公司，宏石SLAN-965熒光定量PCR儀購自中國廈門宏石有限公司，OD-2000TM超微量分光光度計購自美國Thermo Scientific公司。

1.2方法

1.2.1石蠟組織DNA提取 用相應的石蠟塊切片，制成8 μm厚的切片5張，經二甲苯脫蠟、乙醇漂洗后，顯微鏡觀察篩選出腫瘤組織豐富的區域刮取適量組織，并根據DNA提取試劑盒說明書的操作步驟進行DNA提取。

1.2.2基因突變檢測及判斷 抽取DNA后采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)直接測序法來檢測BRAF基因第15號外顯子，以判斷其是否發生突變。操作方法：將DNA原液以5 mg/L濃度稀釋，按每管DNA稀釋液 ∶Taq酶為13.5 μL ∶1.5 μL 的比例，以3 μL/孔加入裝有檢測混合液的8聯管中，采用熒光定量PCR檢測儀按照試劑盒說明書進行PCR擴增：95 ℃預變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸60 s(采集熒光)，40個循環，得到相應Ct值。同時滿足以下3點可認為擴增成功[6]：(1)待測樣本和陽性質控的內控信號升起;(2)陰性對照內控信號和外控信號均無升起;(3)陽性質控的外控信號Ct值<20。BRAFV600E突變結果判斷：(1)待測樣本外控信號的Ct值≥28，為BRAFV600E未突變；(2)待測樣本Ct值<28則認為BRAFV600E突變。

1.3統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，甲狀腺良性病變與PTC間BRAFV600E基因突變率比較及BRAFV600E基因突變與PTC患者臨床病理特征的相關性分析采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1BRAFV600E基因突變率

對照組患者標本中的50例甲狀腺良性病變均未發生BRAFV600E基因突變，PTC組患者中有248例發生BRAFV600E基因突變(圖1)；PTC組患者BRAFV600E基因突變率(76.3%)明顯高于對照組(0.0%)，差異有高度統計學意義(P<0.001，表1)。

注：樣本擴增曲線未升起(無擴增信號)，說明該樣本在該位點上未發生突變，檢測結果為野生型；反之，樣本擴增曲線升起(有擴增信號)，說明該樣本在該位點上發生突變，檢測結果為突變型。圖1 2組患者BRAFV600E基因突變結果Fig.1 BRAFV600E gene mutation results between two groups

表1 2組患者的BRAFV600E基因突變率比較Tab.1 Comparison of BRAFV600E gene mutation rates between two groups

2.2BRAFV600E基因與臨床病理特征相關性

PTC組患者BRAFV600E基因突變與其年齡、性別、腫瘤病灶數、腫塊大小、組織學亞型及臨床分期比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示BRAFV600E突變與PTC患者預后無關；但與甲狀腺被膜外侵犯、淋巴結轉移及伴有橋本氏甲狀腺炎的差異均有統計學意義(P<0.05)，提示BRAFV600E突變與PTC患者預后有關。見表2。

表2 BRAFV600E基因突變與PTC患者臨床病理特征的相關性[n(%)]Tab.2 Correlation between BRAFV600E gene mutation and clinicopathological features of PTC patients [n(%)]

3 討論

BRAF基因是RAF蛋白酶家族中的重要成員[7]。BRAFV600E基因突變已經被認為是PTC的重要分子標記物[8]，但不同國家研究中，BRAFV600E基因在PTC中的突變率不同，范圍為29%～90%[9-11]。而BRAFV600E在甲狀腺良性病變中突變率為0%，因此被認為其具有非常高的特異性[12]。本研究發現在PTC患者中突變率76.3%，良性病變為0%，與既往研究結果一致。由此可見，BRAFV600E基因突變可作為輔助診斷PTC的指標，對甲狀腺結節惡性腫瘤有較高的陽性預測價值[13]。

目前關于BRAFV600E與PTC患者的年齡、性別、腫瘤大小及數目的相關性存在頗多爭議，如Huang等[14]Meta-analysis分析發現BRAFV600E基因突變與患者的年齡和性別無關；有報道指出[15]，BRAFV600E基因突變僅與患者的年齡有顯著相關性；秦東廣等[16]研究發現BRAFV600E突變與腫瘤直徑大小(≥1cm與<1cm)有相關性；洪玉蓉等[17]研究則認為BRAFV600E基因突變與淋巴結轉移、甲狀腺包膜外侵犯、腫瘤大小及數目均無相關性，證明BRAFV600E基因突變與患者的年齡、性別、淋巴結轉移、甲狀腺包膜外侵犯、腫瘤大小及數目的關聯性存在不確定性。本研究結果表明，BRAFV600E基因突變與患者的年齡、性別、腫瘤大小及數目均無相關性(P>0.05)，說明BRAFV600E基因突變可能與患者的年齡、性別、腫瘤大小及數目無關。

甲狀腺癌的不同亞型不僅表現為不同的突變率，而且有不同的侵襲性。趙躍等[18]研究證實了此論點。本研究中由于研究對象有限，未能觀察到高細胞亞型、柱狀細胞亞型和彌漫硬化亞型這些較為少見的亞型，僅發現BRAFV600E基因突變在PTC患者經典亞型和濾泡亞型中未表現出差異(P>0.05)。證明在PTC的各種亞型中經典亞型和濾泡亞型具有相近的侵襲性。

有研究發現，BRAFV600E突變與PTC患者年齡、甲狀腺腺外侵犯、腫瘤組織大小及其分期顯著相關，認為甲狀腺外侵犯、高臨床分期及淋巴結轉移是PTC重要的預后不良因素[19-20]，但也有文獻報道，BRAFV600E突變和TNM臨床分期無關聯[21-22]。本研究中BRAFV600E突變與甲狀腺臨床分期差異無統計學意義(P>0.05)，而與甲狀腺被膜侵犯及淋巴結轉移有關(P<0.05)。325名PTC組患者中Ⅰ～Ⅱ期患者318名(97.8%)，Ⅲ～Ⅳ期患者僅7人，這可能與人們健康保護意識的增強及診療條件不斷完善密切相關，同時也提示對疾病早發現、早治療可減少Ⅲ～Ⅳ期患者的發病率。本研究中甲狀腺被膜外侵犯組的BRAFV600E陽性率(96.3%)，高于無被膜外侵犯組BRAFV600E陽性率(74.5%，P<0.05)，這與大部分的文獻報道一致。有觀點認為BRAFV600E突變與PTC患者的淋巴結轉移具有相關性[23-25]，但也有人認為BRAFV600E突變與淋巴結轉移無明顯相關性[26-27]。本研究PTC患者中淋巴結發生轉移者的BRAFV600E突變率高于未發生轉移者(P<0.05)，因此推測伴有BRAFV600E基因突變的PTC患者更易發生淋巴結轉移，提示臨床可對這部分患者應采取更為積極的治療方案以減少復發風險。

橋本氏甲狀腺炎是一種慢性炎癥，可下調BRAFV600E突變率，降低頸中央區淋巴結的轉移率，使腫瘤的侵襲性下降，對甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展有著重要的影響[28]。有研究認為伴有橋本氏甲狀腺炎的患者BRAFV600E突變率相對較低，提示橋本氏甲狀腺炎可能是PTC患者的一個潛在保護因素[29]。本研究中未伴橋本氏甲狀腺炎的PTC患者BRAFV600E突變率(88.0%)高于伴橋本氏甲狀腺炎者(52.0%，P<0.05)，結論支持上述文獻報道。

綜上所述，BRAFV600E基因突變在不同甲狀腺疾病患者中表現各異，尤其是與PTC的淋巴結轉移、甲狀腺外膜侵犯及伴發橋本氏甲狀腺炎等密切相關，提示其有望成為評估PTC診斷、治療及預后的指標，但本研究為單中心回顧性研究，還需擴大樣本量，進一步探討及驗證BRAFV600E與PTC的臨床病理特征相關性及機制。