細胞培養密度對乳腺癌4T1細胞增殖、遷移、黏附及浸潤能力的影響*

陳騰祥，孫密欣,2，肖俊，董宇華，熊英，蘭金芝，雷珊，張金娟**

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.河北省邯鄲市第一醫院 中心實驗室，河北 邯鄲 056000；3.貴州醫科大學 生物與工程學院, 貴州 貴陽 550025)

乳腺癌(breast cancer)是常見的女性惡性腫瘤，其發病率和死亡率均呈逐年上升趨勢[1-2]。調查顯示，乳腺癌位居女性癌癥發病率的第1位、病死率的第2 位[3]，嚴重影響女性身心健康。目前臨床手術治療、放化療等治療方案在不斷改進，使得乳腺癌患者5年生存率有所提高[4-5]。乳腺癌的生存率依然不容樂觀，這主要與乳腺癌的轉移復發有關[6]。癌組織的微環境是影響癌細胞轉移復發的重要因素[7-10]，癌細胞的增殖能力越強，癌組織在短期內的細胞數也就也多，細胞的生存密度也就越大，細胞的生存密度是癌組織發展的重要因素之一[11-13]。細胞密度因素對于癌組織的發生發展的影響，目前文獻報道不多，為了解細胞密度對癌細胞增殖和轉移能力的影響，本研究以4T1乳腺癌細胞作為研究對象，以60%和90%的細胞培養匯合度來模擬癌細胞的高密度或低密度的生存環境，通過增殖、遷移、黏附和浸潤等實驗評估癌細胞的增殖及轉移能力。

1 材料與方法

1.1實驗材料

4T1小鼠乳腺癌細胞株購自廣州市吉妮歐生物科技有限公司，CO2恒溫培養箱(Model 310型)購于美國Thermo公司，超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購于蘇州凈化設備有限公司，倒置顯微鏡(CKX41)購于日本Olympus公司，離心機(Allegar 64R)購于美國Beckman公司，酶標儀購于美國BioTek公司，DMEM(高糖)培養基購于美國Hyclone公司，胎牛血清購于美國Gibco公司，胰酶粉劑購于北京索來寶公司，細胞培養板(96孔、24孔、12孔)購于中國無錫耐思生物科技有限公司，Transwell小室購于美國Millipore公司，Matrigel膠購于美國DB公司，吉姆薩染色劑和MTT試劑盒購于北京索來寶公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 4T1乳腺癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養基，于37 ℃、5% CO2條件下培養，待細胞長至對數生長期，將細胞接種于6 cm培養皿中。培養至匯合度為60%(sparse組)和90% (dense組)，如圖1所示，分別取高密度和低密度培養的4T1細胞進行后續實驗。

1.2.2細胞克隆實驗 經高密度和低密度培養的4T1細胞，分別制備成2×105個/L的單細胞懸液，以1 mL/孔將細胞接種于24孔板，繼續培養至肉眼可見細胞集落時，吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并計數(每孔隨機選取5個視野)，實驗重復3次。

sparse(匯合度約60%) dense(匯合度約90%)圖1 高、低密度培養的乳腺癌4T1細胞(100×)Fig.1 4T1 breast cancer cells cultured in low and high density(100×)

1.2.3劃痕實驗檢查細胞遷移率 高密度和低密度培養的4T1細胞，制成9×108個/L的細胞懸液，以每孔3 mL接種于6 cm培養皿中培養過夜、細胞鋪滿，用200 μL槍頭在單層細胞上呈劃“一”字痕，漂洗去除懸浮細胞，換成不含血清的DMEM，于0 (即刻)、6、12和18 h時在倒置顯微鏡下觀察和拍照，用photoshop軟件測量劃痕寬度，算出細胞遷移距離，計算細胞遷移率。細胞遷移率=(初始劃痕寬度-檢測時寬度)/初始劃痕寬度，實驗重復3次。

1.2.4Transwell小室實驗觀查細胞遷移率 取高密度和低密度培養的4T1細胞，分別制成單細胞懸液(2×108個/L)；取細胞懸液200 μL加入Transwell小室，下室為全培養基600 μL；培養18 h后，取出Transwell小室，擦除室內殘余細胞，甲醇固定膜外細胞，吉姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每孔取5個視野進行統計。遷移率=測試組跨膜細胞/對照組跨膜細胞 ×100%，實驗重復3次。

1.2.5黏附實驗計算細胞相對黏附率 取高密度和低密度培養的4T1細胞，分別制成單細胞懸液(2×108個/L)，以100 μL/孔加入預鋪了BSA的96孔板中(設3個空白孔)，培養60 min，漂洗掉未黏附的細胞。加入含5%MTT的DMEM 120 μL，37 ℃孵育3 h，棄上清，加入DMSO震蕩10 min，在酶標儀上570 nm處OD值，扣除空白對照組背景，以dense組細胞孔OD值為相對值，計算細胞相對黏附率，實驗重復3次。

1.2.6浸潤實驗 取高密度和低密度培養的4T1細胞，分別制成單細胞懸液(4×108個/L)，將細胞鋪到Traswell小室的Matrigel(預先制備)上，下室為含5%FBS的DMEM，培養24 h，擦除小室內的Matrigel和細胞。固定漂洗后，吉姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察和拍照(每孔取5個視野)，實驗重復3次。

2 結果

2.1細胞克隆實驗結果

與sparse組比較，dense組的4T1細胞形成克隆數目明顯增多，差異有統計學意義(P<0.01)，且形成的單個克隆面積更大。見圖2。

注：A為肉眼所見，B為鏡下所見；(1)與sparse組比較，P<0.01。圖2 細胞培養密度對乳腺癌4T1細胞克隆形成的影響Fig.2 The effect of cell culture density on the colony formation of 4T1 breast cancer cells

2.2細胞遷移率

劃痕實驗結果顯示，與sparse組比較，dense組的4T1細胞更快地遷移覆蓋劃痕處；劃痕18 h后，dense組細胞的遷移率為(87±6)%，顯著高于sparse組細胞的遷移率(48±12)%，差異有統計學意義(P<0.01，圖3)。與sparse組細胞比較，dense組細胞穿過Transwell小室碳酸脂膜的細胞數顯著增多，以dense組4T1細胞的遷移率為100%，sparse組4T1細胞遷移率為(19±6)%，差異有統計學意義(P<0.01，圖4)。

注： A為高、低密度培養來源的4T1細胞劃痕愈合情況，B為統計學處理結果；(1)與sparse組比較，P<0.01。圖3 劃痕實驗檢測細胞培養密度對乳腺癌4T1細胞遷移能力的影響Fig.3 The effect of cell culture density on migration of 4T1 breast cancer cells evaluated by wound healing assay

注：A為高、低密度培養來源的4T1細胞Transwell跨膜遷移情況(吉姆薩染色，×200)，B為統計學處理結果；(1)與sparse組比較，P<0.01。圖4 Transwell實驗檢測細胞培養密度對乳腺癌4T1細胞遷移能力的影響Fig.4 The effects of cell culture density on the migration capacity of 4T1 breast cancer cells tested by Transwell migration assay

2.3細胞的黏附率和浸潤能力

以 dense組的細胞粘附率作為100%，sparse組細胞的黏附率為(39±24)%，差異有統計學意義(P<0.05)。Transwell細胞浸潤實驗顯示，dense組細胞穿過Matrigel基質膠和小室碳酸脂膜的細胞數明顯增多，差異有統計學意義(P<0.01，圖5)。表明經過高密度培養的細胞獲得了更強的黏附和遷移能力。

注：A為dense和sparse組的4T1細胞相對黏附率，B為Transwell-Matrigel浸潤細胞圖(吉姆薩染色，×100)，C為Transwell-Matrigel實驗浸潤細胞計數直條圖；(1)與sparse組比較，P<0.05。圖5 細胞培養密度對乳腺癌4T1細胞的黏附和浸潤能力的影響Fig.5 The effect of cell culture density on the adhesion and invasion of 4T1 breast cancer cells

3 討論

在癌癥發生發展的過程中，癌細胞的增殖和轉移是不同的生物學過程，這兩個過程可以同時發生，也可以在不同的時期和環境中單獨發生或依次發生[14-15]。隨著癌細胞的增殖和組織中細胞密集，會使微環境發生相應變化，反過來會對癌細胞的發生發展產生影響[16-17]。對于具有高轉移能力的癌細胞，在高密度的環境下，其增殖和轉移能力是否都得到了提高，是值得關注的問題。

4T1細胞是來源于BALB/c小鼠種系的乳腺癌細胞株，具有高度的成瘤性和轉移性，其在小鼠體內形成的移植瘤和轉移病灶被認為是臨床4期人乳腺癌的理想動物模型[18-19]，為了探討具有高度轉移特性的4T1乳腺癌細胞在體外的增殖和轉移能力是否受細胞密度的影響，本研究檢測了經過高、低密度培養的4T1細胞的增殖、克隆形成、遷移、浸潤和黏附能力，結果發現，經過高密度培養后，上述能力均有所提高。這與文獻[20]的研究結果一致，他們利用3D培養技術對纖維肉瘤細胞株HT1080進行高、低密度培養，結果發現，高密度培養的HT1080遷移和增殖能力更強。利用低成瘤性和低轉移性的MCF7和WI-38進行觀察，細胞培養密度對這些細胞的增殖、遷移和浸潤能力的影響并不明顯。這些結果說明高轉移性的癌細胞在高速增殖后，即啟動了轉移的程序。然而，為什么高轉移性的癌細胞獲得了這種能力，這可能有缺氧、營養缺乏、局部組織液的酸化或旁分泌的微環境影響，也可能有關鍵基因變異或表觀遺傳學的變化，這些還有待深入研究。