海馬神經元原代細胞培養方法的改良*

高超，杜貴琴，許永劼，朱金鳳，潘衛,2,3**，李興,4

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院 貴州省產前診斷中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學 環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004；4.貴州中醫藥大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550002)

隨著糖尿病發生率的增高，由糖尿病引起的腦代謝異常也日益引起大眾的關注[1]。糖尿病腦病是一種多發性因素引起的復雜性病變，胰島素的絕對或者相對不足、高血糖致使大腦神經元微環境的紊亂是糖尿病腦病發病的重要因素[2-4]。臨床研究發現，海馬是2型糖尿病患者最先受累的腦區，同時也是阿爾茨海默癥最先產生病變的部位[5-6]。海馬是記憶鞏固的重要部位，發揮著學習以及認知功能的作用，信息儲存也是海馬組織的功能之一。海馬組織屬于大腦邊緣系統，大部分由椎體神經元構成，種類單一，是體外研究糖尿病腦病細胞模型的理想選擇[7]?，F階段，國內外對原代培養海馬神經元細胞的方法很多，但都存在一定問題，如膠質細胞過多、細胞純度過低等。因此，本研究旨在提供一種改良的海馬神經元原代培養方法，減少雜質細胞干擾，提高細胞純度，為后續糖尿病腦病的機制研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物和試劑 選取出生24 h內SD乳鼠100只，體質量4～6 g[合格證號為SCXK(黔)2018-0001]，由貴州醫科大學實驗動物中心供給。 試劑包括Neurobasal-A培養基(美國Gibco公司)、DMEM高糖型培養基(美國Gibco公司)、B-27營養因子(美國Gibco公司)、0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)、D-hanks液(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國Hyclone公司)、馬血清(美國Hyclone公司)、左旋多聚賴氨酸(PLL，美國Sigma公司)、L-谷氨酰胺(美國Gibco公司)、CCK-8檢測試劑盒(中國凱基公司)、兔抗鼠神經元特異性烯醇化酶(NSE，美國abcam公司)、4%多聚甲醛(索萊寶公司)以及免疫組化抗體稀釋液(索萊寶公司)。

1.1.2主要儀器 Thermo-3111型CO2培養箱(日本SANYO公司)、VL-4型無菌操作臺(珠海市再鑫儀器有限公司)、IMARK型酶標儀(美國Bio-Rad公司)、倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、數碼顯微鏡(日本Nikon公司)以及超純水儀(四川沃特爾水處理設備有限公司)。

1.1.3主要溶劑的配置 0.25 mg/L的左旋多聚賴氨酸(PLL)溶液：稱取PLL后超純水溶解，配制0.25 mg/L的溶液，經過濾器過濾細菌后備用。種植型培養基：DMEM培養基、馬血清、胎牛血清、L-谷氨酰胺以及雙抗，比例為83 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1。維持型培養基：Neurobasal-A培養基、B-27、谷氨酰胺以及雙抗，比例為96 ∶2 ∶1 ∶1。PBS溶液：稱取PBS粉末10 g溶解于1 L超純水中，高壓滅菌備用。

1.2原代培養海馬神經元細胞

1.2.1細胞培養板的預處理 取6孔板、24孔板、96孔板進行預處理。其中24孔板預先放置細胞爬片。用0.25 mg/L的左旋多聚賴氨酸(PLL)處理培養板，包被8 h或者過夜，放置在培養箱中，使用前用PBS清洗3遍，置于超凈工作臺晾干，備用。

1.2.2細胞培養 (1)取出生24 h內SD乳鼠，在75%酒精中清洗30 s，斷頭后，用彎剪刀剪開頭蓋骨，將整個大腦放入預冷的D-hanks 液中，在數碼顯微鏡下用眼科鑷緩緩將大腦剝開，選取海馬體，用鑷子輕輕剝去“新月形”海馬組織，在數碼顯微鏡下，將海馬體上的被膜和血管完全剝離，盡量保證海馬的完整性，將剔除干凈的海馬組織放在預冷的種植培養基中。(2)將取下來的海馬組織剪碎至1 mm ×1 mm ×1 mm 大小，靜置2 min棄去上清液，加入種植培養基3 mL，用加樣槍吹打20次后，靜置2 min，吸取上清液，重復該步驟。將所取上清液放入離心機中離心5 min，轉速設定850 r/min，把上層液體去掉，37 ℃加入0.125%胰蛋白酶消化20 min，每隔5 min搖晃培養皿，使其充分消化，在顯微鏡下觀察組織塊上無細胞后，加入等體積的胎牛血清終止消化，過程中輕輕吹打數次，200目篩網過濾，放入離心機中離心5 min，轉速設定850 r/min，把上層液體去掉，制成單細胞懸液加入種植培養基。(3)細胞接種，將6孔板和96孔板事先用L-多聚賴氨酸包被，然后把細胞懸液調整至2×108個/L的濃度種植于其中，培育8 h，倒掉種植培養基，用PBS清洗3遍，換成維持型培養基培養，每隔2 d進行換夜。

1.3海馬神經細胞純度鑒定

將細胞爬片用多聚賴氨酸進行處理，放入24孔培養板中，將細胞懸液以(1～5)×108個/L的濃度接種到其中，放入培養箱培養至5 d，用PBS沖洗細胞爬片3次，每次2 min，后用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min。使用NSE免疫組化染色試劑盒鑒定海馬神經細胞純度，隨機選取顯微鏡的視野，重復8次計算100個細胞中海馬神經細胞的數量，取其平均值，海馬神經元純度為陽性百分率。

1.4CCK-8法檢測細胞活力

將細胞懸液以(1～5)×108個/L的濃度接種到預先經過多聚賴氨酸處理的96孔板中，海馬神經元原代培養至第1、3、5、7、9、14天，全部操作嚴格按照CCK-8試劑盒說明書進行。每組做5個平行孔，培養于37 ℃、5%CO2培養箱內2 d，之后拿出CCK-8溶液，每孔加入10 μL，置于37 ℃水浴箱中孵育2 h，酶標儀測定吸光度(450 nm)。實驗重復3次，每次5個副孔。

2 結果

2.1原代海馬神經元形態觀察

如圖1所示，培養第1天的細胞胞體飽滿透亮，形狀各有不同，呈圓形、橢圓形、不規則形，有光暈明顯圍繞在細胞周圍，且有一部分細胞開始貼壁，細胞上有少量突起，突起之間有少量連接；培養第4天的海馬神經元細胞開始呈聚集狀態，細胞胞體相對于第1天來說增大，突起較之前更為明顯，有突起連接形成網絡；培養第4、5及7天的神經元細胞體積變大、成熟飽滿，細胞胞漿較豐富，細胞光暈更為明顯，突起連接形成的網狀結構也更加明顯；培養第11、13天的神經元比較成熟，突起連接形成的網狀結構也交錯復雜，由于一部分神經元細胞開始退化，培養液內有懸浮的退化的細胞碎片使得細胞背景模糊不清晰。

圖1 不同培養天數的海馬神經元細胞的形態變化(倒置顯微鏡，×200)Fig.1 Morphological changes of primary hippocampal neurons (inverted microscope，×200)

2.2海馬神經元細胞活性檢測

培養第1～6天海馬神經元細胞活性逐漸增強，第7天時細胞活性達峰值，并在第7～9天有一個短暫的平臺期，第11天后細胞活性逐漸下降，見圖2。

圖2 海馬神經元細胞活性檢測Fig.2 The viability of cultured primary hippocampal neurons

2.3代海馬神經元純度鑒定

NSE免疫組織化學染色培養7 d細胞，其中部分凸起和胞漿染色為棕灰色或者黃棕色的顆粒，計為海馬神經元。海馬神經元純度為90%。見圖3。

圖3 NSE法鑒定海馬神經元純度(NSE,×200)Fig.3 IHC staining of NSE in primary hippocampal neurons(NSE,×200)

3 討論

在研究神經系統疾病中，神經元是體外細胞培養的理想模型。海馬是神經元比較集中的組織，非神經元細胞較少，同時海馬作為學習記憶的主要場所，在認知功能中扮演重要角色，故在進行體外神經元的原代培養時作為首選[8-9]。已有研究證明，糖尿病腦病的發生發展與大腦海馬區生物學功能的改變密切相關，海馬的結構與功能正常與否直接影響到糖尿病患者的認知功能[10]?，F階段，原代培養海馬神經元的方法雖多，但培養效果存在很大問題，如雜質細胞過多、背景臟等問題。因此，本研究通過改良傳統的培養方法，提供一種穩定高效的海馬神經元原代培養方法，能為后續研究糖尿病腦病以及多種神經退行性疾病提供理想的體外細胞模型。

查閱文獻[11-12]，總結最近幾年的原代培養海馬神經元方法，發現培養海馬神經元主要存在以下幾個問題：(1)在取材過程中，不注意海馬組織上被膜和血管的剔除。實驗結果表明，如果血管未剔除干凈，消化分離時會殘存較多的紅細胞和成纖維細胞，使得在細胞計數和濃度摸索時造成困難，同時也會影響海馬神經元本身的生長。被膜中含有較多的神經膠質細胞，膠質細胞本身會競爭性抑制神經元生長發育。本研究在數碼顯微鏡視野下，使用眼科鑷將海馬組織中的被膜和血管剔除干凈，極大降低了雜質細胞。(2)消化不易控制。在取下完整的海馬組織后，無法確定最佳的消化工具和作用時間，其中消化工具常為胰酶或木瓜酶。但胰蛋白酶活性強不易控制，任玥等[13]采用木瓜酶，相對于胰蛋白酶力度溫和，極大的改進了原代培養中酶消化環節所帶來的時間和劑量難以控制的問題。非酶消化法因成本過高，使用較少。本研究綜合上述發現，選擇稀釋后濃度為0.125%胰蛋白酶為工具，發現該濃度的胰蛋白酶作用溫和，減低細胞損傷。在消化時間上，本研究選擇15～20 min，每隔5 min搖晃培養皿并觀察消化情況，及時終止消化，避免損傷細胞。(3)細胞純化不足。神經元培養最重要的問題就是如何提高其純度，抑制非神經元細胞生長。很多研究發現在培養基中加入阿糖胞苷可以顯著抑制非神經元細胞生長，但這種方法無法很好控制阿糖胞苷的作用時間和作用濃度，很容易導致神經元細胞生長受到影響[14-15]。還有研究發現，采用 B27無血清培養基可以選擇性地使神經元生長，而抑制非神經元細胞的生長和增殖[16-18]。研究同樣證明了這一點，加入B27的無血清培養基能夠較好的抑制非神經元細胞生長，且作為神經元特異性刺激因子，對神經生長作用顯著，能夠起到純化神經元的作用。(4)有研究發現初始種植密度對神經元貼壁無影響，但會嚴重影響軸突和樹突的伸展，從而影響細胞間信號的傳遞。神經元細胞密度過高過低都會直接影響細胞的狀態，當密度過大，細胞會出現接觸抑制、爭奪營養等現象，使其無法完全發育成熟；而過低的培養密度如0.5×108/L也是不利的，Kaech等[19]研究證實，低密度培養下的海馬神經元很難維持長時間的培養，發揮生物信息傳遞的功能。本實驗依據李一鵬等[20]方案，選擇(1～5)×108個/L細胞濃度，培養出的神經元細胞胞漿豐富、光暈明顯，發達的突起向外延伸并且變粗分出許多分支，互相連接形成密集交錯的網絡，培養至14 d仍有較強活性。

本研究發現，與傳統直接將剪碎的組織塊加胰蛋白酶消化不同，將海馬組織經剪碎、吹打、離心后，易消化得到更純的神經元。在選材過程中，盡量選擇乳鼠，無需解剖孕鼠，獲得的神經元細胞活性高，同時避免腦部海馬區血管和被膜不易剔除干凈的缺點。整個過程中，將腦組織及海馬全程浸泡在預冷的D-hanks液或種植培養基中，提高細胞的存活率，降低大腦代謝情況。整個殺鼠過程盡量在3 h內完成，減少組織細胞損傷。經本方法原代培養的海馬神經元，細胞胞體形態飽滿，細胞表面光暈明顯，聚集現象突出，細胞突起粗大且致密，互相交織呈密集的網絡結構，經NSE免疫組織化學鑒定純度高達90%以上，具有很好的實用性。

綜上所述，本實驗汲取了前人經驗教訓改良海馬神經元原代培養方法，提高了神經元純度，為體外快速穩定高效培養神經元提供方案，同時也為后續關于糖尿病腦病及其他神經退行性疾病的研究奠定基礎。