ICG磁性PLGA納米粒的制備及其在小鼠體內的腦靶向作用*

楊暢，馬廣龍，張俊朗，Wafa Al-jamal，李勇軍

(1.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室 & 貴州省藥物制劑重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 2.貝爾法斯特女王大學 藥學院, 北愛爾蘭 貝爾法斯特 BT9 7BL；3.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心, 貴州 貴陽 550004)

研究發現，腦腫瘤[1]、腦血管疾病[2]、中樞神經系統感染[3]、精神疾病[4]等腦部疾病對人類的身體健康影響日益增大，因此構建一種新型的腦靶向藥物傳遞系統，使藥物濃集于腦部達到增加療效、降低藥物毒副作用的目的，已經成為全球腦部疾病藥物研發的熱點。吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)是被美國食品藥品監督管理局(food & drug administration，FDA)批準用于臨床的近紅外熒光染料[5-7]，因其具有優異的光學特性、良好的組織滲透力、低生物體干擾性及低毒性等優點，被廣泛作為造影劑應用于熒光成像，但ICG在水中穩定性差、體內消除較快(血液半衰期2～4 min)及細胞攝取率低等缺陷又限制了其在診療方面的應用[5-8]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolic acid)，PLGA]是由乳酸(lactic acid，LA)和羥基乙酸(glycolic acid, GA)這兩種單體按照不同比例縮聚而成，且經美國FDA批準用于組織工程、醫用材料、藥物載體的生物降解高分子聚合物[9-10]。PLGA具有良好的生物相容性、生物可降解性、合成簡單、穩定性高、降解速度可調節以及可塑性良好等特點[9-11]，將ICG載入PLGA，可提高ICG的穩定性，調節其在體內的循環和分布，放大ICG的熒光成像效應[7,12]。本研究將ICG和四氧化三鐵納米顆粒共載于PLGA納米粒中，追蹤四氧化三鐵納米顆粒在磁場中的運行軌跡，以觀察磁性納米粒在小鼠體內的腦靶向情況，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 NOD/SCID gamma(NSG)小鼠，系非肥胖糖尿病(non obese diabetic, NOD)和重癥聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)基礎上敲除白細胞介素2受體γ鏈(interleukin 2 receptor gamma chain，IL-2Rγ)的小鼠，雄性、4只、體質量20～25 g，英國Envigo公司提供，為清潔級動物。本實驗獲得英國貝爾法斯特女王大學批準(NO.2841)。

1.1.2試劑 PLGA(瑞士Corbion Purac)、ICG(美國Adooq)、聚(乙二醇)甲醚-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯)[poly(ethylene glycol) methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide)，PEG-PLGA]、聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol)，PVA]、甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)及12～14 kDa的透析管(英國Sigma-Aldrich)、69%濃硝酸(英國VWR公司)、10 kDa超濾管(愛爾蘭Merck Millipore)，四氧化三鐵納米顆粒(20 g/L，甲苯)由Wafa J. Al-Jamal實驗室提供，實驗用水為超純水。

1.1.3儀器 ENTRIS 224i-1S分析天平(德國賽多利斯)、MERAFUGE 8R冷凍離心機(美國Thermo Scientific)、FLUOstar? Omega 酶標儀(英國BMG Labtech)、Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀(英國Malvern Panalytical)、55AA原子吸收分光光度計(美國安捷倫)、JEM-1400Plus透射電鏡(日本JEOL)、直徑8 mm的F645-N52-10磁鐵(英國Magnet Expert)以及Bruker In Vivo Xtreme小動物活體熒光成像儀(美國布魯克)。

1.2方法

1.2.1納米沉淀法制備ICG磁性PLGA納米粒 稱取PLGA 6 mg和PEG-PLGA 4 mg溶于乙腈3 mL中，超聲混合溶解，備用；ICG 1 mg溶于甲醇溶液1.5 mL，與20 g/L四氧化三鐵納米顆粒溶液50 μL混合，加PLGA混合溶液中混合均勻，磁力攪拌下逐滴滴入到5%(W/V)PVA水溶液6 mL中，磁力攪拌4 h，4 ℃、6 000 r/min超濾離心15 min，超純水重懸洗滌沉淀10次，得濃縮液1.2 mL，4 ℃保存，備用。

1.2.2激光粒度分析儀測定ICG磁性PLGA納米粒的粒徑、聚合物分散性指數(polymer dispersity index,PDI)及Zeta電位 取ICG磁性PLGA納米粒溶液10 μL與10 mmol/L NaCl溶液990 μL混合，置于樣品池中，Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀上測定其粒徑、PDI及Zeta電位分布。

1.2.3透射電鏡檢測ICG磁性PLGA納米粒形貌及粒徑 取ICG磁性PLGA納米粒溶液200 μL滴于銅網上，濾紙吸去多余的液體，晾干，置于JEM-1400 Plus透射電鏡中觀察其形貌和粒徑大小。

1.2.4ICG紫外可見吸收光譜測定及標準曲線繪制 取2 g/L ICG標準品溶液5 μL置于96孔板中，與DMSO溶液95 μL混合，2倍稀釋，得100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0及1.562 5 mg/L一系列濃度的ICG標準品溶液，置于FLUOstar? Omega 酶標儀中檢測其紫外可見吸收光譜，并繪制標準曲線。

1.2.5紫外可見吸收光譜法測定ICG的包封率和載藥量 取ICG磁性PLGA納米粒溶液5 μL置于96孔板，加DMSO 95 μL溶液混勻，采用FLUOstar? Omega 酶標儀檢測793 nm處吸光度；采用紫外可見吸收光譜法計算ICG的包封率(包封率=純化后的藥物量×100%/純化前的藥物量)和載藥量(載藥量=納米粒內包封的藥物量×100%/載藥納米粒的總重量)[12-13]。

1.2.6原子吸收分光光度法測定四氧化三鐵納米粒的包封率和載藥量 取ICG磁性PLGA納米粒溶液200 μL于100 ℃金屬浴蒸干，加69%濃硝酸200 μL，80 ℃消化4 h，冷卻至室溫，加超純水稀釋至4 mL，于原子吸收分光光度計上檢測四氧化三鐵納米粒的包封率和載藥量[12]，計算方法同ICG。

1.2.7小動物活體熒光成像 隨機取健康且生長狀態相似的NSG小鼠2只，1只小鼠頭部放置磁鐵，1只小鼠頭部未放置磁鐵；同時經尾靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒溶液(ICG為1 μg/g)，1 h和24 h后分別于小動物活體成像儀下(激發波長為760 nm、發射波長為830 nm、曝光10 s)拍攝其活體熒光成像照片。另取2只健康且生長狀態相似的小鼠，同前述樣操作，經尾靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒溶液(ICG為1 μg/g)1 h后取出腦部，并分別于取腦前后將整體動物和離體腦部置于小動物活體成像儀下(激發波長為760 nm、發射波長為830 nm、曝光10 s)拍攝其熒光成像照片，并利用系統自帶的分子成像軟件對離體腦部的近紅外熒光強度進行定量分析。

1.3統計學分析

2 結果

2.1ICG磁性PLGA納米粒的性質表征

激光粒度分析儀檢測結果顯示，ICG磁性PLGA納米粒的粒徑為(172.77±2.14)nm，PDI為(0.225±0.015)，Zeta為(-4.18±0.67)mV(圖1)；透射電鏡觀察結果顯示，四氧化三鐵納米顆粒表現為黑色小點，均勻分布于PLGA納米粒中，且ICG磁性PLGA納米粒呈球形(粒徑約為200 nm)，與激光粒度分析儀結果一致(圖2)；紫外可見吸收光譜法檢測結果顯示，ICG標準品在DMSO溶液中于793 nm有最大吸收，線性范圍為1.562 5～50.000 0 mg/L(圖3)；ICG磁性PLGA納米粒中ICG包封率和載藥量分別為61.8%和0.165%。四氧化三鐵納米顆粒消解后的包封率和載藥量分別為40.1%和0.042%。

圖1 ICG磁性PLGA納米粒的粒徑和Zeta電位分布Fig.1 Size and Zeta potential measurements of ICG magnetic PLGA nanoparticles

15 000× 60 000×圖2 ICG磁性PLGA納米粒的透射電鏡結果Fig.2 TEM images of ICG magnetic PLGA nanoparticles

圖3 ICG標準品在DMSO中的紫外可見吸收光譜和標準曲線Fig.3 UV-Vis spectra and the standard curves of ICG in DMSO

2.2小動物活體熒光成像

小動物活體熒光成像儀下可見，ICG磁性PLGA納米粒在磁場作用1 h后向放置磁鐵的NSG小鼠頭部聚集，未放置磁鐵的NSG小鼠體內見ICG磁性PLGA納米粒主要集中于腹部，ICG磁性PLGA納米粒在磁場作用24 h后2只小鼠體內均未見明顯的熒光(圖4)；取腦前后，將2只尾靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒的NSG小鼠放置于小動物活體熒光成像儀下觀察，無論是活體動物還是離體組織均顯示放置磁鐵1 h后的NSG小鼠頭部的熒光強度高于未放置磁鐵的NSG小鼠(圖5)，定量分析結果顯示放置磁鐵的NSG小鼠頭部的累積熒光強度約為未放置磁鐵的NSG小鼠的1.2倍(圖6)。

圖4 NSG小鼠靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒后1 h和24 h的活體熒光成像結果Fig.4 In vivo imaging of NSG mice at 1 h and 24 h after intravenous injection ICG magnetic PLGA nanoparticles

圖5 NSG小鼠靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒1 h后整體動物和離體腦部的熒光成像結果Fig.5 Fluorescence imaging of the whole animal and isolated brain at 1 h after intravenous injection of ICG magnetic PLGA nanoparticles in NSG mice

圖6 NSG小鼠靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒1 h后離體腦部內的累積熒光強度Fig.6 Sum fluorescence intensity in isolated brain of NSG mice at 1 h after intravenous injection ICG magnetic PLGA nanoparticles

3 討論

實驗結果顯示制備得到的ICG磁性PLGA納米粒的粒徑約為173 nm，PDI約為0.225，Zeta電位約為-4.18 mV，粒徑較小，尺寸均一，分散度較好。Zeta電位為負值，其負電荷可能來源于PLGA表面末端離子化的羧基，但由于PVA在聚合物表面形成了穩定的網絡結構，屏蔽了聚合物表面電荷，因此其Zeta電位值較低[14]。透射電鏡下四氧化三鐵納米顆粒呈黑色小點，均勻分布于PLGA納米粒中，與原子吸收分光光度法分別從定性和定量兩方面表征了磁性PLGA納米粒，證實PLGA成功將四氧化三鐵納米顆粒載入其中。借鑒Wafa課題組建立的ICG藥物傳遞系統策略[13]，結合ICG磁性PLGA納米粒包封率和載藥量的常見測定方法[12]，通過DMSO破壞ICG磁性PLGA納米粒的結構，將ICG游離出來，通過紫外可見吸收光譜法進行測定，其包封率和載藥量，較其他文獻報道略高[12,15]，這可能與選用的PLGA類型有關。在磁場的作用下，經小動物活體成像儀可觀察到ICG磁性PLGA納米粒在1 h內朝NSG小鼠腦部聚集，證實了ICG磁性PLGA納米粒的確具有一定的腦靶向作用，可用作腦部藥物傳遞系統。但其腦靶向的作用力較弱，僅比無磁場作用的磁性PLGA納米粒高1.2倍。這可能與磁性納米粒在藥物載體中的裝載量較小有關。盡可能的保證在較小的粒徑范圍內提高載磁量，將有助于磁靶向力的進一步提高，從而將更多的藥物運輸到腦部。經24 h動物體內代謝后，未見小鼠體內呈現出ICG的熒光，提示ICG磁性PLGA納米粒可能已經被肝臟代謝或者經腎臟排出體外[16-18]，安全性較好。

目前，用于腦靶向的納米遞藥載體有脂質體、固體脂質納米粒、聚合物膠束、樹枝狀聚合物、碳納米管、聚合物納米粒、磁性納米粒等[19-20]。其中磁性納米粒由于受到機體內部環境(如復雜的血管網絡)、精確磁場的施加方式、磁場強度等問題的影響[21-22]，以及可能出現的微血管聚集栓塞現象[23-25]，導致磁驅動的腦靶向策略的可行性一直不明確。雖然已有科學家通過各種方法成功制備了磁性PLGA納米粒[26-29]，但其主要用于腫瘤[12,26-28]和類風濕性關節炎[29]的治療；只有美國圣約翰大學Sadoqi課題組將其用于腦部藥物傳遞系統[15]。通過熒光檢測ICG磁性納米粒在SD大鼠的組織分布情況，發現游離的ICG不能進入腦部，且游離的ICG和ICG磁性納米粒主要分布于肝、腎、脾和肺部組織。本研究結果顯示經包裹后的ICG磁性納米粒可以進入腦部，且在磁場的作用下進入腦部的ICG較無磁場作用的ICG磁性納米粒多。因此證實ICG磁性PLGA納米粒具有一定的腦靶向作用。通過小動物活體成像儀直接觀察ICG磁性PLGA納米粒在活體動物體內的運行情況，可以更直觀的證實ICG磁性PLGA納米粒的腦靶向作用，進一步減少以往組織分布實驗對于動物取材時人員操作規范性和檢測設備靈敏度的依賴。

綜上所述，ICG磁性PLGA納米粒具有一定的腦靶向作用，可用作腦部藥物傳遞系統。