反式肉桂醛對副溶血性弧菌毒力因子的抑制作用

王 碩,鄧海潮,郭 都,庸琪瑤,趙鵬瑜,鄧瑞莎,石 超,夏效東

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院,陜西 楊凌 712100）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是弧菌科弧菌屬的一種無芽孢、無莢膜、有鞭毛、能運動的短桿或弧桿狀的革蘭氏陰性細菌[1]。副溶血性弧菌是一種常見的嗜鹽菌[2],可在含鹽量為0.5%～8.0%的環(huán)境中正常生長[3],廣泛存在于海水及海產(chǎn)品中,其在夏季（7～9月份）海產(chǎn)品中的檢出率高達50%以上[4],其中蝦類、魚類和貝類受副溶血性弧菌污染尤為嚴重[5]。食用被副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海鮮后,可能會出現(xiàn)腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、腹痛、低熱等癥狀[6],重癥患者還可能脫水、休克、昏迷甚至死亡[7]。有報道稱,副溶血性弧菌已逐漸成為引起我國食源性食物中毒的首要致病菌,嚴重威脅著我國公眾的健康安全[8]。并且在全球范圍內(nèi),副溶血性弧菌也是導致腸胃炎等疾病頻發(fā)的主要致病菌[9-10]。

副溶血性弧菌的致病性與其毒力因子密不可分。細菌的運動性在其侵染宿主細胞的過程中起著至關(guān)重要的作用[11],副溶血性弧菌能夠通過口腔進入人體胃腸道,通過黏附腸上皮細胞、穿越腸道屏障,進而侵入血管破壞宿主體內(nèi)環(huán)境,引發(fā)疾病[12]。因此,黏附和侵入人體腸上皮細胞是副溶血性弧菌引發(fā)感染的必經(jīng)途徑。并且副溶血性弧菌易在食品加工機械表面和食品包裝上形成生物被膜,生物被膜對細菌起著保護作用,這使得細菌對環(huán)境的耐受能力大大增強[13-14]。副溶血性弧菌的這些毒力因子使得其具有感染率高、難以被清除的特點,因此,尋求一種安全有效的副溶血性弧菌控制方法對保障公眾安全具有重大意義。

目前,控制副溶血性弧菌感染主要依賴于抗生素類物質(zhì)[15]。但近些年來,抗生素的濫用使諸多問題也隨之涌現(xiàn),主要表現(xiàn)為細菌耐藥菌株增加和耐藥性增強[16],這給使用抗生素治療疾病的方式帶來了巨大的挑戰(zhàn)。近年來,植物源活性物質(zhì)因具有天然、安全和營養(yǎng)等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注[17],其抑菌功效也成為許多學者的研究熱點[18]。肉桂醛是肉桂精油的主要活性成分,主要存在于肉桂樹皮中,在自然界中的天然存在形式為反式肉桂醛（C9H8O）[19]。反式肉桂醛已被美國食品藥品監(jiān)督管理局列為公認安全的食品成分。研究表明,反式肉桂醛具有多種生物活性,可在抗癌、抗炎、治療糖尿病等方面發(fā)揮功效[19],且對阪崎克羅諾腸桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7等有良好的抑制效果[20]。然而,反式肉桂醛對副溶血性弧菌毒力因子的抑制作用及其機制鮮有研究。

基于此,本研究將探究反式肉桂醛對副溶血性弧菌毒力因子的抑制作用。首先,通過測定反式肉桂醛對副溶血性弧菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）,以評價其抑菌效果,并確定亞抑制濃度；在此基礎上,探究在亞抑制濃度下,反式肉桂醛對菌體泳動運動性、生物被膜形成能力和黏附及侵入Caco-2細胞能力的影響,并探討反式肉桂醛對副溶血性弧菌多種毒力因子的抑制作用,旨在為反式肉桂醛進一步應用于食品工業(yè)中控制食源性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）標準菌株ATCC 17802、ATCC 33847購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection,ATCC）；副溶血性弧菌分離菌株202、209、210、253、258、259、260、261由香港理工大學食物安全及科技研究中心分離自鮮蝦。實驗所用的Caco-2細胞（人克隆結(jié)腸腺癌上皮細胞）購于武漢大學細胞保藏中心。

反式肉桂醛（純度≥99%） 美國Sigma公司；質(zhì)量分數(shù)3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（3% NaCl tryptone soya agar,3% NaCl TSA）、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯（3% NaCl tryptone soya broth,3% NaCl TSB）北京陸橋技術(shù)有限公司；DMEM細胞培養(yǎng)液 美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）以色列Biological Industries公司。

1.2 儀器與設備

微生物全自動生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；KB-900脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HF90 CO2恒溫培養(yǎng)箱 上海力申科技儀器有限公司；Model 680酶標儀 美國Bio-Rad公司；S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；JS680B凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及菌懸液制備

將凍存于-80 ℃的副溶血性弧菌采用劃線法在3% NaCl TSA平板上活化,37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落接種于30 mL 3% NaCl TSB中,將培養(yǎng)液置于37 ℃培養(yǎng)18 h,培養(yǎng)后的菌懸液經(jīng)離心（5 000×g、5 min,4 ℃）去除上清液,使用pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline,PBS）洗滌兩次后,使用3% NaCl TSB調(diào)整菌懸液在600 nm波長處的OD值為0.5,此時菌懸液濃度約為108CFU/mL。

1.3.2 反式肉桂醛對副溶血性弧菌MIC的測定

參照Shi Chao等[21]的方法,利用液體稀釋法測定反式肉桂醛對副溶血性弧菌（2 株標準菌株和8 株分離菌株）MIC。將1.3.1節(jié)中所得菌懸液稀釋至濃度為5×105CFU/mL,并將100 μL菌懸液加入96 孔酶標板中。向每孔加入反式肉桂醛溶液,使每孔中反式肉桂醛的終質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5 μg/mL,隨后檢測樣品的OD600nm。將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后,再次檢測OD600nm,比較樣品培養(yǎng)前后的OD600nm。若兩者相差小于0.05,則認為測試質(zhì)量濃度的反式肉桂醛能夠抑制細菌的生長,所對應的最低質(zhì)量濃度即為反式肉桂醛對副溶血性弧菌的MIC。

1.3.3 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802亞抑制濃度的測定

參照Silva-Angulo等[22]的方法測定反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802的亞抑制濃度。將1.3.1節(jié)中最終得到的菌懸液再稀釋100 倍,使菌懸液濃度約為106CFU/mL。向百孔蜂窩板中每孔加入125 μL的菌懸液及125 μL的反式肉桂醛溶液（使用3% NaCl TSB配制）,使各孔中反式肉桂醛的終濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC和1/64 MIC。樣品對照組添加125 μL菌懸液及125 μL 3% NaCl TSB,背景空白對照組添加250 μL 3% NaCl TSB。設置微生物全自動生長曲線分析儀的培養(yǎng)溫度為37 ℃,每隔1 h檢測每孔樣品在波長600 nm處的OD值并繪制生長曲線,選擇質(zhì)量濃度低于MIC且對副溶血性弧菌的正常生長無明顯抑制作用的最高的3 個質(zhì)量濃度作為本研究的亞抑制濃度。

1.3.4 副溶血性弧菌ATCC 17802泳動能力的測定

反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802泳動運動性影響的測定參照Shi Chao等[21]的方法。稱取LB肉湯培養(yǎng)基0.5 g、氯化鈉0.5 g和瓊脂0.06 g于20 mL蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,121 ℃高壓滅菌,待溫度降至45 ℃左右時,向其中加入反式肉桂醛,使其終質(zhì)量濃度分別為0（對照）、1/64 MIC、1/32 MIC和1/16 MIC,混勻后倒入培養(yǎng)皿,制成泳動平板。冷卻30 min后,吸取1.3.1節(jié)制備的菌懸液5 μL,接種至泳動平板表面,37 ℃培養(yǎng)7 h。隨后使用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照,并測量副溶血性弧菌向周圍泳動區(qū)域（泳動圈）的半徑,并計算出泳動圈面積。

1.3.5 副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成能力的分析

1.3.5.1 結(jié)晶紫染色法定量檢測

參照Naves等[23]的方法,選取成膜能力較強的副溶血性弧菌ATCC 17802按照1.3.1節(jié)中的方法制備菌懸液,并將菌懸液濃度調(diào)整至OD600nm＝1.0,配制質(zhì)量濃度分別為1/32 MIC和1/16 MIC的反式肉桂醛溶液和菌液的混合液,以不含反式肉桂醛、3% NaCl TSB為空白對照,取各組混合液250 μL轉(zhuǎn)移至96 孔酶標板后,分別置于10 ℃和25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h和72 h。測定各時間點時所有孔溶液的OD630nm。隨后,吸出菌液,每孔用無菌水漂洗一次,烘干20 min,再向每孔加入1 g/100 mL結(jié)晶紫溶液,室溫下染色20 min,染色結(jié)束后吸出染料,每孔用無菌水漂洗3 次,烘干30 min,然后用冰乙酸溶解。最后使用Model 680酶標儀測定OD570nm。本實驗副溶血性弧菌的生物被膜成膜能力用生物被膜形成（specific biofilm formation,SBF）指數(shù)表征,其按下式計算。

1.3.5.2 場發(fā)射掃描電子顯微鏡定性觀察

參考Gowrishankar等[24]的方法,利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡定性觀察反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成能力的影響。按照1.3.1節(jié)中的方法稍作修改制備菌懸液,將菌懸液調(diào)整至OD600nm＝1.0。將反式肉桂醛溶液與菌液等體積混合,使反式肉桂醛終質(zhì)量濃度分別為0（對照）、1/32 MIC和1/16 MIC,將玻璃片（直徑6 mm）浸入混合液中,置于25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。取出玻璃片后用無菌水漂洗15 s,再用新的無菌水清洗5 s。隨后加入體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液,置于4 ℃冰箱12 h初步固定。使用PBS和無菌水分別清洗玻片約15 s,再加入沒過玻璃片的適量體積分數(shù)1%鋨酸固定5 h。隨后用體積分數(shù)30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液進行梯度洗脫,每次約10 min,靜置晾干后進行真空干燥及噴金處理,置于場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.5.3 副溶血性弧菌ATCC 17802黏附及侵入Caco-2細胞能力的測定

反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802黏附及侵入Caco-2細胞能力的測定參照Amalaradjou等[25]的方法。首先,將濃度為1×105cells/mL處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中恒溫培養(yǎng)18 h,隨后,使用無菌PBS輕柔清洗3 次。取1.3.1節(jié)中菌懸液,添加反式肉桂醛溶液,使反式肉桂醛的質(zhì)量濃度分別為0（對照）、1/64 MIC、1/32 MIC和1/16 MIC,將樣品置于37 ℃恒溫搖床（100 r/min）培養(yǎng)6 h。取出樣品進行離心（5 000×g、5 min,4 ℃）,使用含體積分數(shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋菌體濃度至106CFU/mL。向預先培養(yǎng)的細胞中每孔分別加入1 mL菌懸液后離心（600×g、5 min）,隨后將上清液放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1 h。

在黏附實驗中,恒溫培養(yǎng)1 h后取出樣品并吸出孔板內(nèi)液體,使用無菌PBS清洗細胞3 次。向每孔中加入1 mL體積分數(shù)0.1% Triton X-100,置于4 ℃下處理20 min后使細胞裂解,使用移液器取孔中液體來回吸打,使得細胞及其碎片充分懸浮于液體中,并將所有液體全部轉(zhuǎn)移至新的離心管中。將離心管中液體進行10 倍梯度稀釋后涂布于3% NaCl TSA上,于37 ℃培養(yǎng)24 h后讀數(shù),計算黏附Caco-2細胞的菌體數(shù)量。相對黏附率以處理組黏附菌量占對照組黏附菌量的比例表示。

在侵入實驗中,恒溫培養(yǎng)1 h后取出樣品并吸出孔板內(nèi)液體,使用無菌PBS清洗細胞1 次。向每孔中加入1 mL含有100 μL/mL慶大霉素和體積分數(shù)1% FBS的DMEM培養(yǎng)液,于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)30 min以殺滅Caco-2胞外細菌。隨后離心（600×g、5 min）去除上清液并使用無菌PBS清洗3 次,向每孔中加入體積分數(shù)0.1% Triton X-100,并置于4 ℃下作用20 min以裂解細胞。最后,使用無菌PBS 10 倍梯度稀釋進行涂布,37 ℃下培養(yǎng)24 h后,讀數(shù)并計算侵入Caco-2細胞的菌體數(shù)量。相對侵入率以處理組侵入菌量與對照組侵入菌量的比值表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗進行獨立的3 次重復實驗,采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖,結(jié)果以平均值±標準差的形式表示,并通過SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,采用T檢驗進行顯著性檢驗,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 反式肉桂醛對副溶血性弧菌的MIC結(jié)果

反式肉桂醛對副溶血性弧菌MIC的測定選取了2 種標準菌株和8 種分離菌株進行,結(jié)果見表1。反式肉桂醛對副溶血性弧菌標準菌株ATCC 17802的MIC為50 μg/mL,對ATCC 33847的MIC為100 μg/mL,對8 株分離菌的MIC均為100～200 μg/mL。由于副溶血性弧菌ATCC 17802具有泳動運動性、生物被膜形成能力、黏附及侵入Caco-2細胞能力等毒力表征[26],因此選擇ATCC 17802作為后續(xù)研究對象。

表1 反式肉桂醛對副溶血性弧菌的MICTable 1 MIC of trans- cinnamaldehyde against Vibrio parahaemolyticus

2.2 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802的亞抑制濃度

圖1 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802生長曲線的影響Fig.1 Effect of trans-cinnamaldehyde on the growth curve of Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802

反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802的生長曲線的影響如圖1所示。與對照組相比,當反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/2 MIC時細菌的延滯期明顯延長。當反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/4 MIC時細菌的對數(shù)生長期與對照組相比有明顯的差異。當反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC時,細菌的生長情況與對照組相比幾乎無差異,細菌可正常生長繁殖,因此,本研究選擇1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC為反式肉桂醛對副溶血性弧菌的亞抑制濃度。

2.3 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802泳動運動性的影響

圖2 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802泳動能力的抑制作用Fig.2 Trans-cinnamaldehyde inhibited swimming motility of Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802

反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802泳動運動性的影響如圖2所示。經(jīng)過反式肉桂醛處理的菌體泳動圈面積與對照組相比明顯減小。對照組中副溶血性弧菌的泳動圈面積為（7.22±0.05）cm2。與對照組相比,經(jīng)1/64 MIC的反式肉桂醛處理后,副溶血性弧菌ATCC 17802的泳動圈面積極顯著降低至（5.01±0.18）cm2（P＜0.01）,1/32 MIC和1/16 MIC的反式肉桂醛處理后,泳動圈面積分別極顯著降低至（4.76±0.22）cm2（P＜0.01）和（3.89±0.19）cm2（P＜0.01）。因此,亞抑制濃度的反式肉桂醛對副溶血性弧菌的泳動運動性有良好的抑制作用。

2.4 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成能力的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度反式肉桂醛在10 ℃（A）和25 ℃（B）作用下對副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成能力的影響Fig.3 Effect of different concentrations of trans-cinnamaldehyde on the biofilm formation ability of Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 at 10 ℃ (A) and 25 ℃ (B)

如圖3所示,副溶血性弧菌有較強的生物被膜形成能力,與對照組相比,在10 ℃下反式肉桂醛作用24 h后,1/32 MIC和1/16 MIC濃度條件使副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成量分別下降了29.59%和33.91%；作用48 h后分別極顯著下降了37.89%和47.31%（P＜0.01）；作用72 h后分別極顯著下降了40.86%和44.08%（P＜0.01）（圖3A）。與對照組相比,不同質(zhì)量濃度的反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜的形成量均有抑制作用,并且呈濃度依賴性。

如圖3B所示,1/16 MIC的反式肉桂醛在25 ℃下作用24 h后對副溶血性弧菌的生物被膜形成能力有顯著的抑制作用（P＜0.05）；反式肉桂醛作用48 h后對副溶血性弧菌的生物被膜形成能力沒有顯著的抑制作用（P＞0.05）；在72 h時,經(jīng)1/32 MIC反式肉桂醛處理的副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成量下降了5.68%,而1/16 MIC濃度使生物被膜形成量極顯著下降了45.44%（P＜0.01）。

2.5 副溶血性弧菌ATCC 17802形成的生物被膜微觀結(jié)構(gòu)

如圖4所示,對照組中副溶血性弧菌的生物被膜致密均勻,分布緊湊,布滿整個視野（圖4A）；而在1/32 MIC反式肉桂醛作用下,菌體形成的生物被膜稀疏、松散、分布不均（圖4B）；經(jīng)1/16 MIC反式肉桂醛處理后,菌體形成生物被膜時,生物被膜中的細菌量明顯減少,生物被膜結(jié)構(gòu)更加松散（圖4C）。結(jié)果表明,反式肉桂醛能夠抑制副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜的形成能力,且呈質(zhì)量濃度依賴性。

圖4 副溶血性弧菌ATCC 17802形成的生物被膜掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron micrographs of biofilm formed by Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802

2.6 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802黏附及侵入Caco-2細胞能力的影響

圖5 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802黏附（A）及侵入（B）Caco-2細胞的影響Fig.5 Effect of trans-cinnamaldehyde on the ability of Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 to adhere to (A) and invade (B) Caco-2 cells

如圖5A所示,反式肉桂醛能夠顯著降低副溶血性弧菌黏附Caco-2細胞的能力,并且呈濃度依賴性,當反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/64 MIC時,細菌的黏附率降低至對照組的44.2%；當反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/32 MIC和1/16 MIC時,細菌的相對黏附率分別降至42.9%和24.9%,與對照組呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。

由圖5B可知,反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802侵入Caco-2能力具有明顯的抑制作用,并且隨反式肉桂醛質(zhì)量濃度的增加,相對侵入率逐漸下降。與對照組相比,當反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/64 MIC和1/32 MIC時,細菌的相對侵入率分別降至對照組的58.2%和48.3%,與對照組呈顯著性差異（P＜0.05）；當反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/16 MIC時,細菌的相對侵入率降至對照組的34.5%,與對照組呈極顯著差異（P＜0.01）。

3 討 論

本研究首先測定了反式肉桂醛對副溶血性弧菌的MIC,以評價反式肉桂醛對副溶血性弧菌的抑菌功效。結(jié)果表明,反式肉桂醛對副溶血性弧菌的MIC為50～200 μg/mL,抑菌效果良好。選擇1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC為反式肉桂醛對副溶血性弧菌的亞抑制濃度,在亞抑制濃度下,細菌的生長及存活不會受到影響,因此實驗可排除反式肉桂醛對細菌存活及生長的影響。在Li Guanghui等[27]研究安石榴苷對沙門氏菌泳動運動能力和侵入HT29細胞能力的影響時,選用了1/16 MIC和1/32 MIC為亞抑制濃度；Sivaranjani等[28]發(fā)現(xiàn),亞抑制濃度（1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC）的桑色素可對單增李斯特菌的毒力因子產(chǎn)生有效的抑制作用；本實驗研究了亞抑制濃度（1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC）反式肉桂醛對副溶血性弧菌運動性、生物被膜形成能力、黏附及侵入Caco-2細胞能力的影響,旨在共同闡述反式肉桂醛對副溶血性弧菌毒力因子的抑制作用。

副溶血性弧菌的運動性與其毒力密切相關(guān),并且影響著其對宿主細胞的黏附及侵入能力[26]。細菌依靠鞭毛的定向運動是病原菌作用于宿主細胞并引發(fā)感染的第一步,因此抑制病原菌的運動性可有效降低其感染能力[29]。在本研究中,與對照相比,經(jīng)亞抑制濃度反式肉桂醛作用后的副溶血性弧菌的泳動圈直徑極顯著下降,表明反式肉桂醛能夠有效抑制副溶血性弧菌的運動能力。Upadhay等[30]證明了亞抑制濃度的反式肉桂醛能將空腸彎曲桿菌的泳動運動能力降低70%以上；Packiavathy等[31]發(fā)現(xiàn)100 μg/mL的姜黃素可使副溶血性弧菌的泳動運動能力顯著降低；Bai Jinrong等[32]證明0.312 5、0.625 mg/mL和1.250 mg/mL的莽草酸可抑制金黃色葡萄球菌的運動能力。本研究中,亞抑制濃度的肉桂醛可顯著降低副溶血性弧菌的運動性,從而降低了副溶血性弧菌侵染宿主引起感染的可能性。Guo Du等[26]研究發(fā)現(xiàn),百里醌可通過降低鞭毛合成基因flaA、flaM和flaL的相對轉(zhuǎn)錄量來抑制副溶血性弧菌的運動性,而反式肉桂醛是否是通過降低flaA、flaM和flaL基因相對轉(zhuǎn)錄量來阻礙副溶血性弧菌鞭毛的合成,從而抑制副溶血性弧菌的運動能力,還有待進一步探討。

細菌的生物被膜可使細菌產(chǎn)生對抗生素的抗性[33],并且生物被膜形成的封閉基質(zhì)還能夠增加細菌對環(huán)境壓力的耐受性[34]。在該研究中,采用結(jié)晶紫染色法將結(jié)晶紫與胞外多糖結(jié)合,檢測洗脫液的SBF指數(shù),進行生物被膜定量檢測,并通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡對樣品進行電子照射,定性地觀察由副溶血性弧菌形成的生物被膜。實驗結(jié)果表明,隨著反式肉桂醛質(zhì)量濃度的增加,副溶血性弧菌生物被膜的形成量相比于對照組下降明顯,并且生物被膜結(jié)構(gòu)松散。證明了反式肉桂醛對副溶血性弧菌的生物被膜形成能力具有良好的抑制作用。Kang Jiamu等[35]利用結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn),0.25～2.00 mg/mL的沒食子酸可顯著抑制福氏志賀菌生物被膜的生成量；Fan Qiuxia等[36]利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),1/16 MIC和1/32 MIC的輔酶Q0可以使單增李斯特菌形成的生物被膜變薄、結(jié)構(gòu)變松散；張芳等[37]用1、5、10 μg/mL的白藜蘆醇處理單增李斯特菌后,其生物被膜形成量分別減少10.40%、21.03%和39.10%。在本研究中,反式肉桂醛能夠有效抑制副溶血性弧菌的生物被膜生成量,這會使得副溶血性弧菌對環(huán)境壓力的抵抗能力降低,從而降低其危害性。群體感應是影響細菌生物被膜形成的主要因素之一[38],細菌間的群體感應由細菌合成、分泌的AI-2信號分子所調(diào)控,而由luxS基因編碼合成的LuxS蛋白是AI-2分子合成的關(guān)鍵酶[39]。反式肉桂醛是否能通過抑制luxS基因的相對轉(zhuǎn)錄量來抑制其生物被膜的形成,還需要進行進一步探究。

黏附及侵入宿主腸上皮細胞是食源性致病菌感染宿主的必要途徑[40]。有研究表明,病原菌的黏附作用可使細菌黏附在宿主細胞表面,并且黏附作用為致病菌侵入宿主細胞進而引發(fā)宿主的感染提供了有利條件[41]。副溶血性弧菌能夠通過口腔進入人體胃腸道,進而黏附及侵入腸上皮細胞引發(fā)感染。因此,抑制副溶血性弧菌黏附及侵入腸上皮細胞的能力是降低其毒力的有效方法。本研究結(jié)果表明,反式肉桂醛能夠降低副溶血性弧菌黏附及侵入Caco-2細胞的能力。在先前的研究中,Shi Chao等[21]證明了1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC檸檬醛可有效降低阪崎克羅諾腸桿菌黏附及侵入Caco-2細胞的能力；Inamuco等[11]研究表明,雖然香芹酚不會影響沙門氏菌的黏附能力,但會使其侵入腸上皮細胞的能力降低。本研究結(jié)果表明,反式肉桂醛可降低副溶血性弧菌侵染宿主細胞的能力,降低副溶血性弧菌對人體的感染能力。Sun Yi等[2]研究發(fā)現(xiàn),副溶血性弧菌黏附及侵入宿主細胞的能力與副溶血性弧菌的運動能力有關(guān),因此推測,副溶血性弧菌黏附及侵入Caco-2細胞能力的減弱是由于反式肉桂醛阻礙了副溶血性弧菌鞭毛的合成,導致其運動性減弱。

綜上所述,反式肉桂醛對副溶血性弧菌有良好的抑制效果,其對副溶血性弧菌的MIC為50～200 μg/mL；并且亞抑制濃度的反式肉桂醛可抑制副溶血性弧菌的多種毒力因子,包括副溶血性弧菌的泳動運動能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入Caco-2細胞能力。以上研究結(jié)果表明,反式肉桂醛具有降低副溶血性弧菌對人體的感染能力的潛力,這為反式肉桂醛的進一步開發(fā)應用于控制副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供了理論依據(jù)。