幽門螺桿菌感染患兒血清外泌體蛋白組分差異探討

堯戰勇 張亮 許春娣 傅睿,4（通訊作者）

（1 南昌大學江西醫學院 江西 南昌 330006）

（2 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院兒內科 上海 201801）

（3 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院兒內科 上海 200025）

（4 江西省兒童醫院腎內科 江西 南昌 330006）

現知全世界約一半人群感染了幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)，且我國也有42%～90%高感染率[1]。研究已證明，Hp 作為致病因子，不僅與胃炎、消化性潰瘍、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤乃至胃癌的發生密切相關，還是引起包括心腦血管、血液系統、呼吸系統、肝膽、皮膚、營養代謝及自身免疫病等胃腸道以外疾病的重要因素[2]。近年來研究發現，外泌體是一種由多種細胞分泌的，直徑為30 ～150nm，電鏡下呈球狀或杯狀，來源于細胞內吞途徑中的多泡小體。外泌體富含母細胞成分，通過傳遞蛋白質、脂類和核苷酸在細胞通訊中發揮重要作用。在正常和病理狀態下，外泌體廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等體液中[3]。我們提取Hp 感染患兒血清外泌體，并通過蛋白質組學分析外泌體中的蛋白組分，為Hp 感染作為致病因子所致相關疾病的發病機制的研究提供思路。

1.資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源及分組 選取2017 年2 月—2018 年2 月因反復惡心嘔吐、反酸、噯氣、腹脹、上腹部疼痛等上消化道癥狀來上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院及瑞金北院兒內科就診的慢性胃炎患兒，隨機選取3 例確診為Hp 感染兒童，同期選取3 例健康體檢兒童，分別設為實驗組和對照組，年齡（6 ～37）歲，均經監護人知情同意并簽訂知情同意書。實驗經瑞金醫院倫理委員會同意，符合醫學倫理學標準。

幽門螺桿菌感染陽性判斷標準，同時具備以下兩點：①胃黏膜組織病理學檢查和快速尿素酶試驗陽性；②13C 尿素呼氣試驗。

1.1.2 外泌體提取 應用美國101Bio 的試劑盒PureExo? Exosome Isolation Kit(for serum or plasma)從血清中提取外泌體，經電鏡和粒徑分析，獲得直徑為30 ～150nm 的小囊泡，證明提取的外泌體合格。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白提取和還原烷基化處理 每個樣品取適量進行提取實驗；向其中加入蛋白裂解液，混勻后冰上孵育5min，加入終濃度10mM 的DTT，冰浴超聲15min，然后13000g，4℃離心20min，取上清轉入新的離心管中；向離心管中加入4 倍體積的冷丙酮，在-20℃靜置過夜。離心收集蛋白沉淀，空氣中晾干。加入8M urea/100mM TEAB(pH8.0)溶液重新溶解蛋白，加入DTT至終濃度10mM，56℃水浴30min 進行還原反應。隨后加入IAM 至終濃度55mM，暗處室溫放置30min 進行烷基化反應。Bradford 法測定蛋白濃度。

1.2.2 酶解和除鹽 將來自每個樣品的等量的蛋白質用于胰蛋白酶消化。取100μg 的蛋白質用于胰蛋白酶消化。用100mM TEAB 將蛋白溶液稀釋5 倍后，按1：50 的質量比例（胰酶：蛋白）加入胰蛋白酶，37℃酶解過夜。酶解后的肽段用C18 柱脫鹽，真空冷凍干燥脫鹽后的肽段。

1.2.3 液相色譜-質譜聯用分析 質譜數據采集使用的是TripleTOF 5600 +液質聯用系統（SCIEX）。將多肽樣品溶解于2%乙腈/0.1%甲酸中，并使用與Eksigent nanoLC 系統（SCIEX，USA）偶聯的TripleTOF 5600plus 質譜儀進行分析。將多肽溶液加到C18 捕獲柱（5μm，100μm×20mm）上，并以120min 時間梯度，300nL/min 的流速在C18 分析柱（3μm，75μm×150mm）上進行梯度洗脫。 兩個流動相是緩沖液A（2%乙腈/0.1%甲酸/98%H2O）和緩沖液B（98%乙腈/0.1%甲酸/2%H2O）。對于IDA（信息依賴性采集），以250ms的離子累積時間進行一級質譜圖的掃描，并以50ms 的離子累積時間采集40 個前體離子的二級質譜圖。在350 ～1500m/z 的范圍內采集MS1 光譜，并且在100 ～1500m/z的范圍內采集MS2 光譜。將前體離子動態排除時間設置為15s。

1.3 信息分析流程

1.3.1 原始質譜數據 選用swiss-prot 數據庫的Homo sapiens 序列+污染庫序列，共包含20213 條蛋白序列。

1.3.2 蛋白質的鑒定及定量 鑒定結果的過濾標準為肽段可信度＞=95%，鑒定的蛋白至少包含一個獨特的肽段。通過Skyline 軟件對蛋白質進行定量分析，對檢測到的190 個蛋白進行定量分析，共39 個差異蛋白。

1.3.3 差異蛋白功能分析 采用STRING 軟件中functional protein association networks 進行生物功能和疾病分析。

2.結果

2.1 幽門螺桿菌檢測

實驗組3 例患兒均為上消化道內鏡病理檢查和13C 呼氣試驗雙陽性確診。對照組3 例健康體檢兒童均為血清Hp 抗體及13C呼氣試驗陰性。

2.2 血清來源的外泌體的鑒定

微泡直徑大小在30 ～150nm 之間，呈杯狀凹陷，與公認的外泌體形態一致。

2.3 血清來源的外泌體的蛋白組分分析

在外泌體蛋白中，有190 個蛋白是與數據庫重合的，其中39 個蛋白是實驗組和對照組的差異蛋白，其中上調蛋白19 個，下調蛋白數20 個，其中P最小最顯著差異的蛋白、結合珠蛋白(Haptoglobin,HPT)，對氧磷酶1(Paraoxonase-1,PON1)、纖維連接蛋白(Fibronectin1,FN1)（表1）。顯著差異蛋白的篩選標準為，差異倍數|FC|≥1.5，P＜0.05。

表1 血清來源外泌體所含的差異蛋白比值P 最小前10 個蛋白

2.4 血清外泌體的功能分析

血清來源的外泌體蛋白參與疾病和功能過程，其中參與對脂質過氧化反應、應激反應、急性炎癥反應、蛋白水解調節、內吞作用、防御反應等的功能蛋白在Hp 感染患兒血清外泌體中表達顯著高于健康對照組(圖1)。

圖1 Hp 患兒血清來源的外泌體所含蛋白相關的前10 個功能

3.討論

絕大部分成人Hp 感染是發生在兒童年幼階段，Hp 感染后在胃黏膜上皮細胞定植，通過中性粒細胞、巨噬細胞、T 淋巴細胞和B 淋巴細胞誘導胃黏膜浸潤，這種免疫和炎癥反應自身難以清除[4]，使宿主容易出現慢性炎癥[5]引起并發癥，并持續到成年后期。Hp 感染可能通過改變血脂、增強LDL 氧化、激活炎癥反應參與冠狀動脈粥樣硬化[6]。一項薈萃分析顯示，抗幽門螺桿菌IgG 陽性與動脈粥樣硬化和小動脈疾病引起的缺血性中風(IS)風險密切相關，尤其是對于非心源性栓塞性IS[7]。臺灣學者對臺灣民眾健康保險研究資料庫的大數據分析提示根除H p 與冠心病呈正相關[8]。有學者利用已發表的前瞻性隊列研究確定H p 和冠心病之間的關系，在19 項隊列研究中的13 項研究中觀察到Hp 慢性感染對主要冠心病事件的風險影響增加[9]。Hp 感染是否為心血管疾病危險因素一直存在爭議，Hp 感染后如何致動脈粥樣硬化的發生機制仍有待進一步探討。

近年來，對于外泌體的相關研究倍受關注，外泌體不僅在調控正常生理過程如組織修復、維持干細胞穩態、免疫監視和血液凝固等中發揮重要作用，而且參與許多疾病的病理生理過程。通過對H p 患兒及對照組血清來源的外泌體質譜分析共檢測到190 個蛋白，有顯著差異蛋白39 個，P最小最有顯著差異的蛋白為對氧磷酶1(Paraoxonase-1,PON1)、纖維連接蛋白(Fibronectin1,FN1)、結合珠蛋白(Haptoglobin,HPT)，其中PON1 為下調蛋白，我們將其列為研究對象之一。PON1 能夠水解多種有機磷底物和內酯，以及多種芳香羧酸酯，介導低密度脂蛋白酶的保護作用，防止氧化修飾和由此引起的一系列導致動脈粥樣硬化形成，參與HDL的抗氧化功能，具有動脈粥樣硬化保護作用，推測P O N1 在預防細菌感染中的作用可能與HDLs 在先天免疫中的作用有關[10]。第一篇報道Hp 感染患者的對氧化酶和芳香酯酶活性的論文實驗觀察到Hp 感染陽性組HDL-c 水平顯著低于Hp 感染陰性組，而LDL-c 水平顯著高于陰性組[11]。Hp 可誘導長期存在的低級別持續性炎癥刺激[5]，PON1 活性可能在炎癥過程中降低[12]。血清PON1 活性降低可能與HDL-C 的降低有關，部分與H p 感染引起的氧化應激和炎癥反應有關[11]。在一項前瞻性的臨床研究中表明，PON1 活性的降低是冠心病的獨立危險因素[13]。本研究首次發現在H p 感染的患兒血清外泌體中下調蛋白PON1，Hp 感染后通過什么因子調控PO N1 對降低動脈粥樣硬化以及保護心臟的確切機制仍有待詳細闡明，然而我們的這項研究有一些潛在的局限性，樣本量很小，所以需要在更大的人群中進行進一步的研究。

綜上所述，本研究對比Hp 感染與健康兒童血清外泌體蛋白表達差異，提示Hp 感染可能通過刺激機體慢性持續低度炎癥反應，改變炎癥細胞外泌體組成成分（如PO N1），影響機體健康狀況，如心血管疾病風險，具體靶點細胞及相關信號通路有待進一步研究。