不同方法構建大鼠實驗性牙周炎模型的實驗研究

林珊 戴麗冰（通訊作者） 翁春輝 趙向陽 郭愛芳

（1 廣州市紅十字會醫院＜暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院 廣州市創傷外科研究所＞ 廣東 廣州 510220）

（2 廣東燕嶺醫院口腔科 廣東 廣州 510507）

（3 廣州市紅十字會醫院口腔科＜暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院口腔科＞ 廣東 廣州 510220）

牙周炎屬于非常普遍的慢性免疫炎癥性疾病，導致牙齦組織、牙周韌帶和鄰近的支持性牙槽骨逐漸喪失[1-2]。動物模型有助于研究牙周炎的發病機制及臨床表現的。目前猴子、狗、兔、鼠等動物是目前最主要的造模動物，但大型動物造模受實驗條件和社會倫理問題的限制，在大多數情況下使用大鼠模型成為牙周病研究的一個方向[3-4]。革蘭氏陰性細菌在牙周炎中屬于較為重要的致病菌，而脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）屬于這類細菌重要組成部分，是內源性免疫反應的重要刺激物[5-6]。因此，一個簡單、可復制的大鼠牙周病模型，為人類牙周病的發病機制及防治研究有積極的意義。大鼠通常用于實驗模型，因為磨牙的牙周解剖區與人類有一些相似之處[7-8]。本實驗以斯潑累格·多雷（SD）大鼠為研究對象，參照諸多學者的牙周炎動物模型構造方法，探討出一種快速構建大鼠牙周炎動物模型的有效方式。

1.資料與方法

1.1 實驗動物、器械

SD 大鼠24 只，雌雄均一半，SPF 級，體重(198.95±45.85)g，采購于南方醫科大學,10%水合氯醛（上海國藥集團，生產批號30037517）；乙醇（上海國藥集團，生產批號801769722）；大腸桿菌O 111：B4 株脂多糖（E-LPS） 購自美國Sigma 公司，批號L-2630；正畸結扎絲（上海康橋齒科醫械廠，生產批號：120305）；牙周探針（上海康橋，ALLQX0700）；漢密爾頓注射器10μL。實驗動物許可證證照編號：SYXK(鄂)2018-0042，均符合動物倫理學認可。

1.2 實驗方法

將24 只大鼠隨機分成3 組：健康對照組、LPS 注射組、正畸結扎絲組，均8 只。均使用10%水合氯醛(0.3ml/100g,腹腔注射) 麻醉, 對照組無需任何干預。正畸結扎絲組：正畸結扎絲大鼠在雙側上頜第一磨牙置于齦下，在頰側打結并滴注LPS 2μl。LPS 注射組在顯微鏡下，于大鼠上頜第一、第二磨牙之間腭側牙齦注射2μ l。L P S 注射每2 天1 次，持續2 周。注射過程中沒有觀察到組織炎癥或軟組織損傷明顯的跡象。處置結束等待蘇醒，從實驗日喂食常規鼠料和水，記錄3 組動物活動狀態、飲 食、體重、糞便情況，記錄口腔糜爛及牙周袋形成，記錄其不同之處。在術后1、4 周斷頸處死各組中的3 只大鼠，均取大鼠雙側上頜骨，截取5mm×5mm 標本，及時進行處理。將標本制成頰舌向5μ m 厚的組織切片，蘇木素- 伊紅(H E) 染色，記錄牙周組織情況。

1.3 觀察指標

牙齦出血指數(Sulcus bleeding index，SBI)SBI 評定標準采用Mazza（1981）提出的0 ～5 分記分法，0 為牙齦健康；1 為牙齦輕度水腫，探診不出血；2 為僅在探診出呈狀出血[9-10]；3 為出血沿齦緣擴展；4 為出血溢出齦緣；5 有自發出血傾向或潰瘍形成[11]。牙周探診深度(probing depth，PD)用探針輕探實驗牙的牙周袋，2 每個實驗牙各測量頰側、腭側兩個位點測量，取平均[12-13]。

1.4 統計學方法

2.結果

2.1 臨床表現

2.1.1 術后1 周 正畸結扎絲組大鼠雙側上頜第一磨牙的結扎線有3 只脫落,牙齦呈粉紅色，不出血，與對照組無差異；剩下5 只大鼠結扎絲未脫落，其牙齦稍紅腫，探診不出血。LPS 注射組牙齦向冠方腫脹，未出血。

2.1.2 術后4 周 對照組與1 周時已脫落的結扎絲組，牙齦均為粉紅色，彈性較好；5 只結扎絲未脫落大鼠牙齦暗紅色，探診袋內壁有出血。LPS 注射組牙齦邊緣圓鈍，與牙面未出現貼附，腭側齦緣黏膜糜爛、壞死，探診后牙齦出血，牙齦退縮達釉牙骨質界以下，牙齦糜爛、牙根面暴露，牙齒I°松動 ，見圖1-3。

圖1-3 三組大鼠口內變化情況

2.2 組織病理學改變

2.2.1 術后1 周 對照組、3 只結扎絲脫落及5 只結扎絲未脫落的正畸結扎絲組的大鼠牙齦結合上皮為無角化的鱗狀上皮，牙槽骨表面光滑，未出現骨陷窩及破骨細胞。LPS 注射組大鼠牙齦結合上皮釘突增生，纖維結締組織出現水腫，牙槽骨并未出現變化。

圖4-5 大鼠病理學變化

2.2.2 術后4 周 對照組、3 只結扎絲脫落大鼠的病理變化與對照組之間并無差別。5 只結扎絲未脫落的正畸結扎絲組大鼠，與LPS 注射組大鼠，在牙齦組織中結合上皮向根方增殖、延伸，齦溝壁處出現炎癥，牙周膜膠原變性、降解，但牙周膜間隙寬度增加，牙槽骨出現破壞。牙齦結合上皮出現加深，出現較深的牙周袋，發生炎癥細胞。

2.3 三組間SBI 及PD 值比較

正畸結扎絲組和LPS 注射組干預1、4 周后的SBI 和PD 高于對照組，LPS 注射組干預1、4 周后的SBI 和PD 高于正畸結扎絲組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；三組大鼠干預4 周后的SBI 和PD 高于同期干預1 周后，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠牙周探診深度比較（±s，mm）

表1 三組大鼠牙周探診深度比較（±s，mm）

注：③與②、①同期各項比較，P ＜0.05；①與②同期比較，P ＜0.05；本組干預4 周后與1 周時比較，P ＜0.05。

n SBI PD 1 周 4 周 1 周 4 周正畸結扎絲組① 8 0.9±0.58 1.9±0.61 0.36±0.03 1.31±0.20 LPS 注射組② 8 1.6±0.52 3.6±0.52 0.87±0.02 1.54±0.30對照組③ 8 0.3±0.23 0.6±0.78 0.11±0.11 0.13±0.05

3.討論

牙周炎主要是炎性破壞疾病，患者會合并出現出血、腫脹，包括牙槽骨吸收，形成牙周袋，最后患者牙齒出現脫落與松動[14]。牙菌斑是牙周炎的始動因子，牙菌斑可通過脂多糖促進骨吸收，而重要細菌為革蘭陰性細菌，成為免疫反應重要刺激物[15]。

通過建立牙周炎動物模型，記錄牙周炎病因情況，對致病因子產生良好條件。大鼠屬于嚙齒動物，其牙周情況與人類較為相似，能夠作為良好的實驗工具，牙周組織與人基本一致，且大鼠價格較為便宜，實驗成活率較高，有利于在實驗中進行[16]。

關于實驗性牙周炎動物模型建立的方法，早期國內外均有報道。目前主要實施多種方法的聯合應用，縮短實驗性牙周炎動物模型建立所需的時間，建立符合實驗要求的模型標本。柴巧學等[17]、劉紅等[18]報道采用結扎法均能成功誘導動物牙周病的發生。王瑢等[19]研究表明單純注射LPS 于大鼠磨牙的牙齦組織，最早在注射7d 后就能發現牙槽骨喪失。本次實驗結果發現：LPS注射組的大鼠分別在1、4 周時表現出牙周炎的發展的連續過程，1 周時是牙周病早期牙齦炎的表現，是一個急性滲出性炎癥反應；4 周時，牙齦出現重度急性炎癥反應，牙齦上皮紅腫，并能夠觀察到明顯的潰瘍情況，上皮下結締組織可見大量淋巴細胞浸潤，膠原變性、破壞，牙槽骨破壞明顯，可見死骨形成，屬于典型的急性重度牙周炎活動期的病理表現。

正畸結扎絲組大鼠在2 周時有3 只大鼠結扎線脫落，僅形成牙齦炎的表現，可能是由于大鼠進食的食物較粗糙，結扎期間出現脫落，最終難以形成牙周炎的模型。

本研究采用LPS 注射大鼠上頜磨牙和使用正畸結扎絲結扎法均可成功構建實驗性牙周炎動物模型，操作方法簡單，可重復性好。但結扎絲法有可能因結扎絲脫落而失敗，而注射法在成功建模的同時并且可以縮短建模需要的時間，而且注射部位、劑量等易于控制，缺點在于需要使用微量注射器和較細的針頭并需要在放大鏡下操作[20]，增加了實驗成本。

綜上所述，建立以上兩種牙周炎模型均可成功建模，但局部注射LPS 方法制備牙周炎動物模型更佳。