“自上而下”高分辨串聯(lián)質(zhì)譜法分析德谷胰島素的序列

王建偉　趙莉　田圃

摘 要 基于“自上而下”的序列分析策略，采用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)德谷胰島素的氨基酸序列及B鏈C末端側(cè)鏈非蛋白修飾序列進(jìn)行了全面的分析。優(yōu)化了德谷胰島素的還原條件及串聯(lián)質(zhì)譜的碰撞條件，結(jié)果表明，聯(lián)合使用50 mmol/L三（2-羧乙基）膦及6 mol/L鹽酸胍，在45℃下反應(yīng)40 min即可充分還原德谷胰島素為兩條獨(dú)立的肽鏈;還原產(chǎn)物經(jīng)Accucore C18色譜柱分離，采用靜電場(chǎng)軌道阱高分辨串聯(lián)質(zhì)譜分析，當(dāng)高能碰撞誘導(dǎo)裂解能量分別為20（A鏈）與25（B鏈）時(shí)，可獲得最豐富的質(zhì)譜碎片信息，可滿足生物技術(shù)藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)中100%的序列覆蓋率的基本要求，亦可對(duì)問(wèn)題樣品提供更全面的序列解析。此方法未使用傳統(tǒng)序列分析中昂貴且費(fèi)時(shí)的測(cè)序級(jí)蛋白內(nèi)切酶，降低了引入人為修改的風(fēng)險(xiǎn)，以更準(zhǔn)確地獲得序列信息，節(jié)約了成本，并顯著提高了工作效率，為胰島素類似物的序列分析提供了新的解決方案。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜; 高能碰撞誘導(dǎo)裂解; 德谷胰島素; “自上而下”序列分析; 序列覆蓋率

1 引 言

自從1982年第一個(gè)重組生物技術(shù)產(chǎn)品即人胰島素誕生以來(lái)，包括治療性蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物技術(shù)藥物（Biotechnology medicine）取得了飛速的發(fā)展。 近十年來(lái)，生物技術(shù)藥物在一些疾病治療方面顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)， 出現(xiàn)了一大批明星藥物[1，2]。不同于傳統(tǒng)的小分子化學(xué)藥物，生物技術(shù)藥物一般具有分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差、批間差異大等特點(diǎn)，因此其質(zhì)量控制比化學(xué)藥物更復(fù)雜，需要一系列涵蓋不同分析領(lǐng)域的分析技術(shù)，才能有效地表征其理化屬性[3]。《生物技術(shù)藥物研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）明確要求，對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽類藥物，候選藥物的氨基酸序列原則上應(yīng)與參照藥相同; 在藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)時(shí)，要求對(duì)于氨基酸序列測(cè)定的比對(duì)試驗(yàn)研究，可與已知的參照藥序列直接進(jìn)行比對(duì)。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)序列分析方法包括N-末端分析法（如二硝基氟苯法、丹磺酰氯法、Edman降解法和氨肽酶法）和C-末端分析法（如肼解法、還原法和羧肽酶法[4]）。這些方法操作程序復(fù)雜，工作量大。隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛躍發(fā)展，具有高質(zhì)量精度及寬動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)點(diǎn)的高分辨質(zhì)譜使得生物技術(shù)藥物的序列分析更為便捷[5，6]。質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)序列的原理是基于肽鏈碰撞碎裂產(chǎn)生規(guī)則的碎片（圖1），然后根據(jù)這些碎片的高分辨質(zhì)譜信息組合成肽段的氨基酸序列[7]。

利用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)的序列分析，通常采用“自下而上”（Bottom-up analysis）的分析方法[8]，即首先將完整蛋白經(jīng)限制性蛋白內(nèi)切酶酶解成多肽，再利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，通過(guò)軟件檢索與理論序列的比對(duì)，最終鑒定氨基酸序列與預(yù)期序列是否一致[9]， 這種分析方法應(yīng)用較為廣泛。王綠音等[10]通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定經(jīng)Glu-C酶解產(chǎn)生的肽段，分析得到甘精胰島素肽圖。白海嬌等[11]采用Glu-C酶和Lys-C酶過(guò)夜反應(yīng)，特異性水解各種胰島素，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立含有胰島素特征性片段的肽圖，用于確定各種胰島素。Srzentic等優(yōu)化了天冬氨酸蛋白酶Sap9的反應(yīng)條件，將其用于“自下而上”蛋白質(zhì)組學(xué)中，在酸性條件下Sap9在1 h內(nèi)可有效裂解IgG，從而降低了將人工修飾引入原始樣品的可能性[12，13]。相對(duì)于“自下而上”分析，蛋白質(zhì)不經(jīng)過(guò)酶解直接用質(zhì)譜儀分析的方法即“自上而下”分析（Top-down analysis），大大降低了檢測(cè)成本與樣品處理時(shí)間，也避免了由酶解引入的人為修改，所得的結(jié)果更簡(jiǎn)潔，因而易于分析。然而，未經(jīng)酶解的完整肽鏈長(zhǎng)度遠(yuǎn)大于酶解后的肽段長(zhǎng)度，其質(zhì)譜信號(hào)弱，導(dǎo)致采用“自上而下”分析法得到的肽段覆蓋率相對(duì)有限，對(duì)質(zhì)譜分析提出了更高的技術(shù)要求，包括質(zhì)譜碎裂條件和質(zhì)量分析器的分辨率等，同時(shí)也對(duì)龐大的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析提出了挑戰(zhàn)[14]。Levy等[15]采用最先進(jìn)的Fusion系列靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，聯(lián)合多種質(zhì)譜碎裂方式和多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析粒細(xì)胞刺激因子， 獲得了89%的蛋白序列覆蓋率。Fornelli等[16]通過(guò)多種離子活化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)利妥昔單克隆抗體的“自上而下”質(zhì)譜序列分析，序列覆蓋率大于90%。

糖尿病是威脅人類健康的主要疾病之一，重組人胰島素和胰島素類似物是治療糖尿病的首選藥物。目前有6種胰島素類似物應(yīng)用于糖尿病臨床治療。相較于重組人胰島素，長(zhǎng)效胰島素類似物吸收和擴(kuò)散緩慢穩(wěn)定，藥效平穩(wěn)、無(wú)明顯峰效應(yīng)，且作用時(shí)間長(zhǎng)，能模擬正常人生理性基礎(chǔ)胰島素分泌[17]。德谷胰島素[18]是最新開(kāi)發(fā)出的胰島素類似物，是目前臨床上作用時(shí)間最長(zhǎng)的胰島素類似物。德谷胰島素屬于化學(xué)修飾的重組人胰島素，是在人胰島素分子的基礎(chǔ)上，將B鏈第30位的蘇氨酸去掉，在B鏈第29位賴氨酸側(cè)鏈的ε氨基上，通過(guò)一個(gè)L-γ-谷氨酸連接子，共價(jià)偶聯(lián)了一個(gè)16碳的脂肪二酸（圖2）。

德谷胰島素同重組人胰島素和其它胰島素類似物一樣均為雙鏈結(jié)構(gòu)，需要對(duì)兩條肽鏈分別進(jìn)行序列分析，本研究采用“自上而下”的分析策略，將德谷胰島素還原后，不經(jīng)酶解即采用超高液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-LTQ Orbitrap MS）進(jìn)行分析，優(yōu)化了德谷胰島素還原成兩條單鏈的反應(yīng)條件，以及串聯(lián)質(zhì)譜的碰撞條件，實(shí)現(xiàn)了德谷胰島素的序列表征，包括德谷胰島素A鏈和B鏈蛋白序列分析、B鏈C末端側(cè)鏈非蛋白修飾序列分析。本研究為德谷胰島素等胰島素類似物生產(chǎn)的質(zhì)量控制和藥品質(zhì)量監(jiān)管提供了新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Acquity UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）; Orbitrap Velos Pro靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）; MS3渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）; DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

德谷胰島素注射液（3 mL， 300單位， 丹麥諾和諾德制藥有限公司）; 三（2-羧乙基）膦（TCEP）、甲酸、鹽酸胍（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）; 乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）; NH4HCO3、HCl（分析純，北京化工廠）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 德谷胰島素二硫鍵的還原 德谷胰島素注射液用10 mmol/L HCl溶液稀釋成1 mg/mL，取100 μL至離心管內(nèi)，加入終濃度分別為6 mol/L的鹽酸胍和50 mmol/L的TCEP， 45℃孵育40 min，使德谷胰島素的二硫鍵還原打開(kāi)，兩條肽鏈分離。還原產(chǎn)物用UPLC-LTQ Orbitrap MS分析，進(jìn)樣量為2 μL。

2.2.2 儀器分析條件 液相色譜條件： Accucore C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）; 柱溫45℃; 流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸。線性梯度洗脫： 0～3 min，3% A; 3～17 min，3%～60% A; 17～18 min，60%～95% A; 18～22 min，95% A; 22～22.1 min，95%～3% A; 22.1～25 min，3% A。流速： 0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件： 加熱電噴霧離子源（HESI）; 正離子檢測(cè)模式; 噴霧電壓3.0 kV; 離子傳輸管溫度320℃; 輔助氣溫度300℃; 鞘氣： 35 arb; 輔助氣： 10 arb; S-Lens RF值： 50.0%; 掃描模式： 數(shù)據(jù)依賴型掃描模式（Full MS/dd-MS2）; 掃描范圍： m/z 150～2000; 一級(jí)質(zhì)譜分辨率為60000 FWHM（m/z 400），二級(jí)質(zhì)譜分辨率為15000 FWHM（m/z 400）; 二級(jí)質(zhì)譜碎裂模式： 碰撞誘導(dǎo)解離（Collision-induced dissociation，CID）、高能碰撞誘導(dǎo)裂解（Higher energy collision induced dissociation， HCD）; 碰撞能量（Normalized collision energy， NCE）優(yōu)化范圍： 10～45。

2.2.3 數(shù)據(jù)分析條件 數(shù)據(jù)采集軟件： Thermo Xcalibur 2.2，數(shù)據(jù)處理軟件： BioPharma Finder 3.2，分子量計(jì)算軟件： ChemBioDraw 14.0，計(jì)算所有的a、b、c、x、y和z型碎片離子分子量，按照5 ppm的誤差匹配質(zhì)譜信號(hào)。

3 結(jié)果與討論

3.1 德谷胰島素還原條件的優(yōu)化

蛋白質(zhì)中存在二硫鍵時(shí)，會(huì)影響其二級(jí)質(zhì)譜中肽鏈的碎裂[19]，無(wú)法獲得序列分析所需的豐富的碎片離子，因此，在質(zhì)譜檢測(cè)前需將二硫鍵還原打開(kāi)。常用的二硫鍵還原試劑包括二硫蘇糖醇（DTT）和三（2-羧乙基）膦（TCEP），其中，DTT是一種高效的鏈間二硫鍵還原劑，而TCEP與蛋白變性劑結(jié)合可同時(shí)還原鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵[20]。在還原反應(yīng)過(guò)程中，

如發(fā)生過(guò)度還原（如高溫或者長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)），則會(huì)產(chǎn)生干擾物質(zhì)[21，22]，因此，選擇合適的反應(yīng)溫度與時(shí)間是保證序列分析準(zhǔn)確性的前提。在德谷胰島素的結(jié)構(gòu)中，除了存在兩條鏈間的二硫鍵，A鏈中還存在鏈內(nèi)二硫鍵，因此，本研究采用TCEP與蛋白變性劑鹽酸胍結(jié)合的方法進(jìn)一步優(yōu)化了TCEP的還原溫度和還原時(shí)間。

德谷胰島素有3個(gè)二硫鍵，理論上，其還原反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生8個(gè)還原產(chǎn)物。圖3為德谷胰島素的還原產(chǎn)物經(jīng)UPLC-LTQ Orbitrap MS分析的色譜圖，具體色譜峰歸屬見(jiàn)表1。峰1為存在鏈內(nèi)二硫鍵的A鏈，峰2為還原后的A鏈，峰4、5、6為A鏈和B鏈間存在兩條二硫鍵的還原產(chǎn)物，峰7為還原后的B鏈，峰8、9為A鏈和B鏈間存在一條二硫鍵的還原產(chǎn)物。其中，B鏈（峰7）第29位賴氨酸上修飾了16碳二酸谷氨酰脂肪鏈，其極性明顯小于A鏈（峰2），因此，在C18色譜柱中B鏈液相色譜保留時(shí)間遠(yuǎn)大于A鏈。TCEP能穩(wěn)定還原德谷胰島素的鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵，如圖4所示，50 mmol/L TCEP聯(lián)合6 mol/L鹽酸胍在45℃反應(yīng)，德谷胰島素的含量快速下降，還原后的A鏈和B鏈含量迅速升高，在40 min內(nèi)即可充分還原德谷胰島素成兩條肽鏈。

3.2 質(zhì)譜碎裂條件的優(yōu)化

德谷胰島素經(jīng)TCEP還原后，不經(jīng)酶解即注入U(xiǎn)PLC-LTQ Orbitrap MS進(jìn)行“自上而下”序列分析。為了獲得更多的德谷胰島素碎片離子，比較了兩種常用的串聯(lián)質(zhì)譜碎裂方式： CID和HCD。CID是生物質(zhì)譜中肽段序列分析常用的碎裂模式，肽段活化碰撞后主要產(chǎn)生b、y型碎片離子，進(jìn)而解析序列。CID主要在肽鏈的主鏈發(fā)生碎裂，且在離子阱中有“1/3效應(yīng)”，不能檢測(cè)到小于母離子質(zhì)荷比28%的碎片離子。 HCD是一種高效的肽鏈碎裂模式，在軌道阱質(zhì)譜儀中廣泛應(yīng)用。HCD比CID更容易發(fā)生二次碎裂，有可能產(chǎn)生更多的碎片離子，從而能對(duì)肽鏈的側(cè)鏈修飾進(jìn)行分析。此外，HCD利用軌道阱檢測(cè)離子，克服了離子阱中CID的“1/3效應(yīng)”，掃描范圍更廣，可檢測(cè)到低質(zhì)荷比區(qū)域的離子[23]。文獻(xiàn)[23，24]比較了CID和HCD在N-糖肽中肽段序列和側(cè)鏈糖鏈結(jié)構(gòu)分析中的差異，表明HCD能獲得更全面的糖肽序列信息。

3.2.1 德谷胰島素A鏈的序列分析 德谷胰島素A鏈由21個(gè)氨基酸組成，含有20個(gè)酰胺鍵，其一級(jí)質(zhì)譜主要出現(xiàn)雙電荷峰和三電荷峰。分別考察了CID和HCD模式下， NCE對(duì)德谷胰島素A鏈碎裂程度的影響（圖5）。在CID模式下，A鏈的b離子和y離子碎片都很豐富，檢測(cè)到的酰胺鍵斷裂數(shù)隨著NCE增加而增大，

圖5 在 CID （A）和 HCD （B）模式下，NCE 對(duì)德谷胰島素A鏈雙電荷或三電荷峰碎裂的影響

Fig.5 Effect of normalized collision energy （NCE） on fragmentation efficiency curves of doubly or triply protonated insulin degludec chain A under collision-induced dissociation （CID） （A） or higher energy collision induced dissociation HCD （B） over the NCE range of 10-45最高達(dá)到18個(gè)。 在HCD模式下，A鏈的碎片離子更豐富。由圖5B可見(jiàn)，當(dāng)NCE>25時(shí)，由于高能碰撞造成的二次碎裂使得碎片難于被匹配，而在NCE=20時(shí)，HCD模式能檢測(cè)到雙電荷峰（m/z 1192.51）所產(chǎn)生的全部20個(gè)酰胺鍵的斷裂，序列覆蓋率達(dá)到100%（圖6）。具體HCD裂解片段的質(zhì)譜峰歸屬見(jiàn)電子版文后支持信息表S1。

3.2.2 德谷胰島素B鏈的序列分析 德谷胰島素B鏈?zhǔn)怯?9個(gè)氨基酸組成的肽鏈，以及類似N-糖肽鍵修飾的C末端第29位賴氨酸側(cè)鏈ε氨基上的非蛋白序列組成，共含有30個(gè)酰胺鍵，其一級(jí)質(zhì)譜主要出現(xiàn)了三電荷、四電荷和五電荷的譜峰。在CID和HCD模式下，德谷胰島素B鏈呈現(xiàn)出與A鏈類似的碎裂程度（圖7）。在CID模式下，檢測(cè)到的酰胺鍵斷裂數(shù)最高達(dá)到19個(gè)，且只能在主鏈發(fā)生碎裂。在HCD模式下，碎片離子更豐富，不僅能檢測(cè)到主鏈的酰胺鍵斷裂，還能檢測(cè)到C末端側(cè)鏈氨基上非蛋白序列修飾的酰胺鍵斷裂。在NCE=25時(shí)，能檢測(cè)到五電荷峰（m/z 746.18）所產(chǎn)生的全部30個(gè)酰胺鍵斷裂，序列覆蓋率達(dá)到100% （圖8）。因此，在德谷胰島素B鏈的序列分析中，HCD比CID碎裂模式更具優(yōu)勢(shì)。具體HCD裂解片段的質(zhì)譜峰歸屬見(jiàn)電子版文后支持信息表S2。

4 結(jié) 論

采用“自上而下”高分辨質(zhì)譜法對(duì)德谷胰島素進(jìn)行了完整的序列分析，序列覆蓋率達(dá)到100%。本研究未使用傳統(tǒng)序列分析中的昂貴且費(fèi)時(shí)的測(cè)序級(jí)蛋白內(nèi)切酶，改用TCEP聯(lián)合鹽酸胍還原德谷胰島素雙鏈，結(jié)合HCD質(zhì)譜碎裂方式得到豐富的b、y型等碎片離子，用于其蛋白主鏈及側(cè)鏈非蛋白修飾部分的序列解析。本方法準(zhǔn)確、便捷，為德谷胰島素等胰島素類似物的質(zhì)控提供了新思路，并可用于其它胰島素類似物的序列分析。

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Sequence Analysis of Insulin Degludec by Top-Down

High Resolution Tandem Mass Spectrometry

WANG Jian-Wei1，2， ZHAO Li1， TIAN Pu*1

1（School of Life Sciences， Jilin University， Changchun 130012， China）

2（National Analytical Research Center of Electrochemistry and Spectroscopy， Changchun Institute of Applied Chemistry，

Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022， China）

Abstract The "top-down" high-resolution tandem mass spectrometry method was used for the first time to comprehensively analyze the amino acid sequence of insulin degludec and the non-protein modification sequence of C-terminal side chain of B-chain. The reduction conditions of insulin degludec and the collision conditions of tandem mass spectrometry were optimized. The results indicated that insulin degludec could be fully reduced to two independent peptide chains when tris（2-carboxyethyl） phosphine （50 mmol/L） and guanidine hydrochloride （6 mol/L） were used in combination and reacted for 40 min at 45℃. The reduction products were separated by Accucore C18 column and analyzed by orbitrap high resolution tandem mass spectrometry. When the higher energy collision induced dissociation was 20 for Chain A and 25 for Chain B， the most abundant fragment information could be obtained， which not only met the basic requirements of 100% peptide coverage in biotechnology drug evaluation， but also provided more comprehensive sequence analysis for the problem samples. This method eliminated the costly enzymatic hydrolysis step in the traditional sequence analysis， limited the risk of introducing artifactual modification to obtain better sequence information， thus saved the cost and significantly improved work efficiency， and provided a new solution for sequence analysis of insulin analogs such as insulin degludec.

Keywords Ultra performance liquid chromatography-high resolution tandem mass spectrometry; Higher energy collision induced dissociation; Insulin degludec; Top-down analysis; Sequence coverage

（Received 17 March 2020; accepted 17 April 2020）

2020-03-17收稿; 2020-04-17接受

* E-mail： tianpu@jlu.edu.cn