基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法表征大腸桿菌O77 O抗原寡糖單位生物合成路徑

儲健　賈添元　拱忠影　董晨影　周大煒

摘 要 大腸桿菌O抗原寡糖單位生物合成路徑的研究對于闡明特異性O抗原在細菌生長和致病中所發揮的作用具有重要意義。本研究利用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）技術研究了大腸桿菌O77 O抗原寡糖單位的生物合成路徑，考察了兩個甘露糖糖基轉移酶（WbaD 和WbaC）在大腸桿菌O77 O抗原寡糖單位生物合成過程中的作用，建立了高效、靈敏的細菌 O抗原寡糖重復單位生物合成路徑初步表征方法。首先采用MALDI-TOF MS技術，在負離子模式下，監測WbaD 和WbaC酶促反應產物-脂寡糖形成，初步探索了WbaD 和WbaC的作用方式，應用碰撞誘導解離 （CID）技術對酶促反應產物-脂寡糖的化學結構進行了初步表征。結果表明，WbaD 和WbaC是O77 O-寡糖重復單位合成所需的僅有的兩個糖基轉移酶，WbaD與O77的O抗原中d-Man-d-GlcNAc糖鍵的形成相關，WbaC與O77的O抗原中其余兩個d-Man-d-Man糖鍵的形成相關; WbaD 和WbaC之間同時存在協同合作和交替作用方式。本研究建立的細菌 O抗原寡糖重復單位生物合成路徑高效表征方法為深入探索細菌O抗原生物合成機制和應用生物工程技術大規模合成功能性糖鏈奠定了實驗基礎。

關鍵詞 O抗原寡糖重復單位; 酯寡糖; 生物合成路徑; 基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜

1 引 言

某些致病菌株可以引起人、畜、禽、獸共患的傳染性疾病，在人群密集和衛生條件較差的區域爆發的潛在可能性較大， 特別是近年來，耐多藥和廣泛耐藥菌株的出現，迫切需要尋找新藥物及藥物作用靶點。O抗原是革蘭氏陰性細菌細胞壁最外層的主要成分，由寡糖重復單位組成（幾個到幾十個），構成O-寡糖抗原決定簇，是動物免疫系統對入侵的革蘭氏陰性菌首先識別及攻擊的目標，在致病性細菌侵染宿主細胞過程中起重要作用[1]。在細菌的感染過程中，體液和細胞的免疫應答通常由特異性O-寡糖抗原決定簇決定，從而可確定細菌再次感染時機體可產生的免疫反應[2]。

大腸桿菌細菌表面O抗原寡糖單位的生物合成中，糖基轉移酶將高能核苷二磷酸單糖供體中的單糖轉移到延伸中的寡糖單位上。確定糖基轉移酶基因的特定功能是準確表征O抗原寡糖重復單位生物合成路徑的關鍵。近期的研究表明，細菌糖蛋白多糖部分的變化與細菌感染緊密相關，其生物合成路徑涉及的糖基轉移酶與細菌表面O抗原寡糖單位密切相關[3]。表征糖基轉移酶基因特定功能的常規方法是：首先在大腸桿菌中表達假定的糖基轉移酶基因克隆產物，隨后將表達產物、受體底物（脂載體）和供體底物（NDP-糖）孵育，應用液相色譜監測酶活性并純化制備酶促反應產物，應用一維和二維核磁共振（NMR）技術鑒定糖基轉移酶基因的特定功能[4]。然而，常規方法樣品需要量大，并且實驗過程繁瑣。

基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）技術可提供更靈敏、精準和高重現性的結構信息，為高通量快速檢測糖復合物提供了技術平臺[5～10]。近年來，碰撞誘導解離（CID）MALDI-TOF MS技術不斷發展和完善，如通過應用特異性糖苷外切酶[11]、新型基質的研發[12，13]、定性數據庫的不斷完善[14]以及離子淌度[15]和糖芯片[16，17]的應用等，進一步拓寬了研究領域，并獲得了盡可能多的糖復合物定性信息。

在破譯腸出血性大腸桿菌（EHEC）O77的O抗原基因簇序列基礎上，結合O抗原寡糖重復單位的化學結構，通過搜索序列的同源性，本研究組在前期工作中推測出O77 O抗原寡糖重復單位生物合成途徑涉及β-1，3-甘露糖糖基轉移酶（WbaD）和α-1，2-α-1，2-甘露糖糖基轉移酶（WbaC）（見圖1）。在此基礎上，利用電噴霧碰撞誘導解離串聯質譜（CID-ESI-MSn）技術[18]研究了上述兩個糖基轉移酶的功能。本研究以WbaD和WbaC為研究對象，利用MALDI-TOF質譜技術證明了各自酶促反應產物的形成，進一步應用高能CID-MALDI-TOF質譜技術對相應酶促反應產物的化學結構進行了初步表征，在此基礎上，建立了新的高效、靈敏的細菌 O抗原寡糖重復單位生物合成路徑的初步表征方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

4700 Applied Biosystems基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（美國ABI公司）。甲醇、乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher公司）; α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，美國Fluka公司）; 2-嗎啉乙磺酸（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid， MES）、GDP-Man（美國Sigma-Aldrich公司）; 實驗用水為二次蒸餾水。 大腸桿菌O77 O抗原中wbaD 基因和wbaC基因的克隆、含相應重組質粒的細菌培養及酶促反應細胞膜提取物的制備的方法均參照文獻[18]。由于WbaD和WbaC與細胞膜之間存在相互作用，本研究利用含wbaD或wbaC基因的重組質粒細胞膜部分作為酶的來源，進行酶促反應。

2.2 酶活性測定反應體系

2.2.1 單酶酶促反應體系 1 mmol/L 受體GlcNAc-PP-PhU（或WbaD 酶促反應產物，空白對照以水替代）， 75 mmol/L MES 緩沖液（pH 6.5）， 5 mmol/L MnCl2， 5 mmol/L GDP-Man和10μL 細菌膜提取物（1～12μg，陰性對照分別以大腸桿菌DH5α和 BL21代替細菌膜提取物）。37℃水浴中反應30 min后，沸水浴中加熱3 min，離心（12000 r/min，5 min）。取0.3μL稀釋200倍，取上清待測液與等體積基質，滴于樣品探頭靶心，室溫干燥結晶后，直接分析測試。

2.2.2 雙酶（WbaD 和WbaC）偶聯酶促反應體系 含1 mmol/L 受體GlcNAc-PP-PhU（空白對照以水替代）、 5 mmol/L MnCl2、 75 mmol/L MES緩沖液（pH 6.5）， 5 mmol/L GDP-Man和10μL 細菌膜（WbaD 和WbaC）提取物（1～24μg，分別以大腸桿菌DH5α和 BL21代替細菌膜提取物為陰性對照）。37℃水浴反應一定時間后，沸水浴中加熱3 min，離心（12000 r/min，5 min）。取0.3μL稀釋200倍后，取上清待測液與等體積基質，滴于樣品探頭靶心，室溫干燥結晶后，直接分析測試。

2.3 MALDI-TOF MS條件

Nd：YAG激光器， 波長355 nm， 基質為α-CHCA，反射模式，負離子譜檢測。碰撞誘導解離（CID）質譜實驗中，碰撞小室內碰撞氣體為空氣， 其壓力3.33×104 Pa， 碰撞能量1 kV。為方便質譜解析，本研究將預期的酶促反應產物苯氧基十一烷基二磷酸二和四糖視為五和七糖（寡糖），苯氧基十一烷基和二磷酸基相應地分別代表一個和兩個糖環。所有碎片應用Domon-Costello命名法識別[19]。

3 結果與討論

3.1 WbaD和WbaC酶活性的質譜監測

在負離子模式下，WbaD 酶促反應產物的MALDI-TOF MS分析結果見圖2C，豐度最高的準分子離子峰 m/z 789.2134 [M-H]與Man-GlcNAc-PP-PhU（苯氧基十一烷焦磷酸化二糖）的分子量相對應， 表明WbaD具有明顯的甘露糖轉移酶活性; WbaC酶促反應產物的MALDI-TOF MS分析結果見圖2D，豐度最強的準分子離子峰 m/z 1113.5176 [M-H]與Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU的分子量相對應， 表明WbaD 酶促反應產物在WbaC催化下，甘露糖基被連續轉移到Man-GlcNAc-PP-PhU受體上，最終生成Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU。以大腸桿菌BL21（不含質粒）的細胞膜作為酶促反應的負對照，以水代替給予體底物進行酶促反應的空白對照，均未檢測到相應的糖基轉移酶活性（圖2A和2B）。

3.2 WbaD 酶活性的初步表征

在負離子模式下，WbaD產物的二級質譜圖見圖3。以m/z 789.4332 [M-H]為前驅離子（圖3）， 觀察到4個源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產物離子，分別為m/z 444.5749 [M-H- P-PhU]、m/z 524.6265 [M-H-PhU]、m/z 462.6034 [C3]和m/z 405.5491 [M-Man-H2O-GlcNAc-H]。源于糖苷鍵斷裂的產物離子有m/z 241.2966 [M-H-P-PhU-Man-Ac]和m/z 423.5699 [M-H-Man-GlcNAc]。 m/z 79.1739 [PO3]和m/z 159.0979 [HPO3PO3]源于磷酸二脂鍵部分兩個鍵的同時碎裂;? m/z 691.1074[M-H3PO4-H]源于m/z 789.4332 脫掉1個H3PO4分子。未發現涉及開環的產物離子。

對于WbaD產物， MS2 譜圖（圖3） 中特征碎片離子m/z 423和 405分別對應[PP-PhU-H]及該碎片離子失去水分子得到的碎片離子， 與已發表的PP-PhU 數據一致[18，20]， 同時證明初始受體底物的PP-PhU 基團并未受到酶促反應的影響; 焦磷酸化二糖部分存在3個特征碎片離子m/z 444 [M-H-P-PhU]， m/z 524 [M-H-PhU]和m/z 462.6034 [C3]，可以推斷WbaD催化轉移一個甘露糖殘基到GlcNAc-PP-PhU上，形成了Man-GlcNAc-PP-PhU。

3.3 雙功能酶WbaC 酶活性的初步表征

在負離子模式下，雙功能酶WbaC酶促反應中間產物及終產物的二級質譜如圖4和圖5所示。

以m/z 951.5690 [M-H]為WbaC 酶促反應中間產物的前驅離子， 觀察到4個源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產物離子（圖3），分別為m/z 606.6842 [M-H-P-PhU]、 m/z 686.7902 [M-H-PhU]、m/z 624.7021 [C3]和m/z 405. 4538 [M-H-Man-GlcNAc-H2O-Man]。源于糖苷鍵斷裂的產物離子有m/z 423.4701 [M-H-Man-GlcNAc-Man]。m/z 79.1707 [PO3]和m/z 159.0580 [HPO3PO3]源于磷酸二脂鍵部分兩個鍵的同時碎裂;? m/z 853.1914[M-H3PO4-H]源于m/z 951.5690 脫掉1個 H3PO4分子。未發現涉及開環的產物離子。

對于WbaC 酶促反應中間產物， 同樣在MS2 譜圖（圖4）中， 特征碎片離子m/z 423和 405分別對應[PP-PhU-H]及此碎片離子失去水分子得到的碎片離子， 與已發表的PP-PhU 數據一致[18，20]， 同時證明初始受體底物的PP-PhU 基團并未受到酶促反應的影響; 3個特征碎片離子m/z 606 [M-H-P-PhU]、 m/z 686 [M-H-PhU]和m/z 624 [C3]的存在，可以推斷WbaC催化轉移一個甘露糖殘基到Man-GlcNAc-PP-PhU上，形成了Man-Man-GlcNAc-PP-PhU。

以m/z 1113.5828 [M-H]為WbaC 酶促反應終產物的前驅離子（圖5）， 觀察到4個源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產物離子，分別為m/z 768.8329 [M-H-P-PhU]、4 m/z 848.8521 [M-H-PhU]、 m/z 786.8129 [C3]和m/z 405. 4028 [M-H-Man-GlcNAc-H2O-Man-Man]。m/z 423.4065 [M-H-Man-GlcNAc-Man-Man]為源于糖苷鍵斷裂的產物離子。 m/z 79.1664 [PO3]和m/z 159.0576 [HPO3PO3]源于磷酸二脂鍵部分兩個鍵的同時碎裂;? m/z 1015.3563 [M-H3PO4-H]來源于離子m/z 1113.5828 脫掉 1個H3PO4分子。未發現涉及開環的產物離子。

對于WbaC 酶促反應終產物， 同樣在MS2 譜圖中（圖5）， 特征碎片離子m/z 423和 405分別對應[PP-PhU-H]及此碎片離子失去水分子得到的碎片離子， 與已發表的PP-PhU 數據一致[18，20]， 同時證明初始受體底物的PP-PhU 基團并未受到酶促反應的影響; 3個特征碎片離子m/z 768 [M-H-P-PhU]、 m/z 848 [M-H-PhU]和m/z 786 [C3]的存在，可以推斷雙酶（WbaD 和WbaC）連續催化轉移3個甘露糖殘基到 GlcNAc-PP-PhU上，形成了Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU。上述結果表明，WbaC不僅能添加第二個甘露糖殘基，而且能添加第三個甘露糖殘基，具有雙甘露糖糖基轉移酶功能。雙功能糖基轉移酶并不多見，到目前為止，得到明確表征的雙功能糖基轉移酶有以相同的或不同的糖苷鍵連接方式催化轉移單獨一種單糖的雙功能糖基轉移酶（如Alg11，GDP-Man）[21]， 也有以相同的或不同的糖苷鍵連接方式催化轉移兩種不同單糖的雙功能糖基轉移酶（如AtGALS1，UDP-Gal 和UDP-Arap）[22]。

通過質量數分析發現，WbaD（m/z 789.4332）和WbaC（m/z 1113.5828）產物離子的高能CID MALDI-TOF/TOF MS碎片離子都主要源于磷酸二酯鍵部分的斷裂， 提供的脂寡糖骨架信息可證實新的單糖殘基已經成為脂寡糖的一部分。雖然缺少可提供重要的區域選擇性信息的跨環斷裂碎片離子和源于寡糖部分糖苷鍵斷裂的Y型離子， 無法確定脂寡糖中的寡糖序列和新加入單糖殘基與相鄰單糖殘基間糖苷鍵的鏈接方式，但MALDI-TOF-MS技術能測定完整的糖鏈分子質量， 同時還可以應用CID技術證明新的單糖殘基被轉移到相應的底物脂寡糖，借助已知細菌表面O抗原寡糖單位生化合成途徑涉及的糖基轉移酶生物信息學分析結果，可以實現細菌表面O抗原寡糖重復單位生化合成途徑的高通量初步表征。

需要特別指出的是，針對脂寡糖糖鏈精細結構的表征，現有軟硬件條件下CID-MALDI-TOF/TOF和CID-ESI-MSn都無法表征異頭構型（SymbolaA@或SymbolbA@）。MALDI和ESI質譜在CID 模式下產生的脂寡糖串聯質譜圖均主要表現為源于磷酸二酯鍵部分的斷裂[18， 20]。在涉及脂寡糖中寡糖的連接順序和連接方式的確定時， CID-ESI-MSn提供的結構信息更細致（圖6和圖7）。首先， ESI-MS/MS源于糖苷鍵斷裂的Y型離子是對脂寡糖中的寡糖連接順序進行確認的重要依據之一。其次， 對于糖鏈結構的解析，CID-ESI-MSn 離子阱的多級質譜可提供重要的區域選擇性信息的跨環斷裂碎片離子， 確認脂寡糖中寡糖的連接方式（圖6和圖7）; 而CID-MALDI-TOF/TOF中呈現出一個斷層。再次，CID-MALDI-TOF/TOF能耐受較高濃度的鹽、緩沖劑和其它難揮發成分， 大大地降低了對樣品預處理的要求; 樣品用量少，僅需微升級的樣品溶液; 以單電荷峰為主， 碎片峰少， 有利于對復雜混合物的檢測; 由于在靈敏度、分辨率、速度、通量等指標占絕對優勢，在分析珍稀生物樣品時非常有力。而CID-ESI-MSn方式進行樣品預處理需嚴格除鹽，樣品用量為毫升級， 脂寡糖的跨環斷裂碎片離子需要三級及以上質譜確定。在硬件條件許可的條件下，兩條路線互補使用，在O-重復單位生物合成路徑完整表征的研究中十分必要。

3.4 細菌 O抗原寡糖重復單位生物合成涉及的全部糖基轉移酶作用方式初步探索

高爾基體內多糖的合成不僅依賴糖基轉移酶的催化活性，還取決于其正確的定位及彼此間的時空相互作用[23]。文獻報道的糖基轉移酶間相互作用有協同[24，25]和交替[26，27]兩種方式。借助時間推移分析[28，29]，初步考察了兩個糖基轉移酶的作用方式。初始受體底物為GlcNAc-PP-PhU，給體底物GDP-Man過量，WbaD 和WbaC同時存在條件下，反應開始10 min（圖8A），同時出現Man-GlcNAc-PP-PhU（相對豐度大）和Man-Man-GlcNAc-PP-PhU（相對豐度?。﹥蓚€質譜峰，表明與WbaD協同合作，WbaC催化轉移了第一個甘露糖殘基; 隨后，初始受體底物（GlcNAc-PP-PhU）質譜峰不斷降低，伴隨著WbaD 產物（Man-GlcNAc-PP-PhU）先后徹底消失，然后出現Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU峰（相對豐度小）（圖8B），表明WbaC催化轉移第二個甘露糖殘基，與WbaD以交替方式形成重復單位; 120 min后，隨著Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU峰強度不斷增加，Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU成為唯一的終產物（圖8C）。

4 結 論

在負離子模式下，對大腸桿菌O77兩個甘露糖基轉移酶酶促反應產物（wbaD基因和wbaC基因編碼的）混合物的MALDI-TOF和CID MALDI-TOF/TOF分析結果證明WbaD和WbaC涉及脂多糖的合成：WbaD轉移Man殘基到GlcNAc， 而WbaC連續轉移兩個Man殘基到Man。本方法可方便地用于O-抗原合成涉及的其它糖基轉移酶的分析。除通用的糖基轉移酶（WecA）之外， WbaD 和WbaC是O77 O-重復單位合成所需的僅有的兩個糖基轉移酶。為深入考察O抗原寡糖重復單位的生物合成機制，本研究初步探索了兩個糖基轉移酶的作用方式，發現協同合作和交替方式同時存在。本研究結果為闡明細菌O抗原合成機理，探索O抗原在細菌生長和致病中的作用，以及重組疫苗和應用生物工程技術大規模合成功能性糖鏈提供了實驗依據。

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Characterization of Biosynthetic Pathway of Tetrasaccharide Repeating

Unit of Escherichia Coli O77 O-antigen by Matrix-assisted Laser

Desorption-Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry

CHU Jian1， JIA Tian-Yuan2，3， GONG Zhong-YING4， DONG Chen-Ying 2，3， ZHOU Da-Wei*2，3

1（School of Automation and Electrical Engineering， Tianjin University of Technology and Education， Tianjin 300222， China）

2（TEDA Institute of Biological Sciences and Biotechnology， Nankai University， Tianjin 300457， China）

3（Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology， Ministry of Education， Nankai University， Tianjin 300457， China）

4（Department of Neurology， Tianjin First Center Hospital， Nankai University， Tianjin 300192， China）

Abstract Mass spectrometry is a rapid， sensitive and accurate approach for the direct monitoring of enzyme-catalyzed reaction that does not require chromophore or radiolabeling， and thus provides a viable alternative to existing analytical techniques. Herein， a simple and efficient assay for characterization of E. coli O77 O-unit biosynthetic pathway by using matrix-assisted laser desorption-ionization （MALDI） mass spectrometry with collision-induced dissociation （CID） was demonstrated by WbaD and WbaC （two glycosyltransferases from E. coli O77 O antigen） lipooligosacharide enzymatic products， respectively. The rapid and direct monitoring of the enzymatic reaction was achieved by subjecting a small amount （0.3 μL） of the reaction mixture to MS analysis without chromatographic separation or desalting steps， and subsequent MS-MS analyses of their lipooligosacharide enzymatic products via collision-induced dissociation enabled the structure of the products of enzyme-catalyzed reaction to be determined. The results demonstrated that WbaD catalyzed the transfer of the first Man residue to GlcNAc-PP-PhU and formed Man-GlcNAc-PP-PhU， and WbaC acted actted after WbaD， adding two Man residues to the growing polymer. Furthermore， the model for E. coli O77 O-unit biosynthesis was studied with the help of time-lapse analysis， and it was proposed that WbaC and WbaD acted in both cooperative and alternating fashion to form the repeat unit and WbaC did not act in tandem with WbaD. Collectively， these data demonstrated that a high-energy CID MALDI-TOF/TOF MS-based platform was applicable to the facile characterization of biosynthetic pathways of O-unit and offered significant advantages over current methods in terms of speed， sensitivity， reproducibility， automation and reagent costs， which would open new way for the future mechanistic study of O-unit biosynthesis and exploitation of these fascinating glycocatalysts.

Keywords O-antigen oligosaccharide repeating unit; Lipooligosaccharide; Biosynthetic pathway; Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry

（Received 29 December 2019; accepted 12 June 2020）

This work was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities， Nankai University （No. 63191133） and the Tianjin Enterprise Science and Technology Commissioner Project （No. 18JCTPJC65600）.

2019-12-29收稿; 2020-06-12接受

本文系中央高校基本科研業務費專項資金項目（No.63191133） 和天津市企業科技特派員項目（No. 18JCTPJC65600） 資助

* E-mail： daweizhou@nankai.edu.cn