氣相色譜-質譜法測定血漿中31種游離脂肪酸含量

劉佩珊,牟 燕,馬安德,周枝鳳

(南方醫科大學 公共衛生學院 衛生檢驗檢疫學系,廣東 廣州 510515)

脂肪酸是脂質的重要組成部分,是維持人體生長發育和健康所必需的物質。血漿中的游離脂肪酸(FFAs)組成是膳食脂肪酸的攝入及內源性脂肪酸代謝的反映,FFAs種類多達40余種[1]。血漿中FFAs代謝失衡會引起心血管疾病、腫瘤、免疫和代謝性疾病等多種疾病[2]。妊娠期婦女血漿中FFAs代謝異常,不僅影響母體健康,還會影響胚胎發育,導致胎兒生長發育遲緩和神經系統發育異常[3]。因此,為更好地反映人體FFAs代謝狀況,建立一種高效、靈敏、較全面測定血漿中FFAs含量的分析方法尤為重要。

氣相色譜法(GC)和氣相色譜-質譜法(GC-MS)是目前測定FFAs最常用的方法[4],這兩種方法測定血漿中FFAs含量的樣品前處理通常包括兩個步驟：血漿中的FFAs經有機溶劑提取后,在衍生化試劑的作用下與甲醇發生酯化反應,生成對應的脂肪酸甲酯(FAMEs)[5]。脂肪酸提取的常用溶液體系有氯仿-甲醇和甲基叔丁基醚-甲醇溶液。常用衍生化方法有酸催化和堿催化,其中酸催化常以硫酸、鹽酸、乙酰氯和三氟化硼為衍生化試劑[6],但鹽酸催化反應時間長,易引入副產物,不適合大樣本量檢測[7]；而三氟化硼毒性強、保質期短,易與氧氣反應[8]。堿催化法主要用于動物油脂的衍生化,不適用于游離脂肪酸的甲酯化[9]。為節省時間和減少試劑耗材的使用量,有報道提出了直接衍生化樣品的“一步”反應法,但其回收率低于“兩步”反應[10]。目前,大部分分析方法所檢測的FFAs種類較少,僅4～20余種[6-7,11-12]。本研究比較了不同脂肪酸提取方法及衍生化方法對血漿中FFAs測定的影響,優化了衍生化反應條件,并結合氣相色譜-質譜將其用于孕婦血漿樣本中FFAs的檢測,可獲得較全面、準確可靠的FFAs信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QP 2010 Plus氣相色譜-質譜聯用儀(日本島津公司),配AOC-20i+s自動進樣器。包含31種脂肪酸甲酯在內的37種脂肪酸甲酯混合標準溶液(1 mL,不同濃度溶于二氯甲烷,美國Supelco公司)；十九烷酸甲酯(C19>∶ 0,IS)、十三烷酸(C13>∶ 0)、二十三烷酸(C23>∶ 0)(100 mg,純度>99%,上海安譜實驗科技股份有限公司)；甲醇(色譜純,美國Merck公司)；正己烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、乙酰氯和甲醇鈉(色譜純,德國CNW公司)；三氟化硼-甲醇溶液(14%三氟化硼溶于甲醇,上海麥克林生化科技有限公司)；鹽酸、硫酸、甲苯、氯仿、無水碳酸鉀和氯化鈉均為分析純(廣州化學試劑廠)；實驗用水由Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)制備。

1.2 標準溶液及質控樣品的配制

取37種脂肪酸甲酯混合標準溶液,用二氯甲烷>∶ 正己烷(體積比1>∶2)稀釋2、3、3.33、6.66、40、100、500、2 000倍,配制校準曲線用系列標準溶液。分別稱取適量C13>∶ 0和C23>∶ 0標準品,用正己烷>∶甲醇(體積比1 >∶4)溶解并稀釋制得1.6、100、640 μg/mL的質控標準溶液,用于計算回收率、精密度和準確度。稱取適量C19>∶ 0標準品,用二氯甲烷>∶ 正己烷(體積比1>∶2)溶解配成25 μg/mL的內標(IS)標準溶液。血漿質控樣品：取50 μL血漿于離心管中,加入10 μL 100 μg/mL質控標準溶液,渦旋1 min,用于計算方法回收率、精密度和準確度。

1.3 FFAs提取

提取方法①[13]：向血漿質控樣品中加入750 μL氯仿>∶ 甲醇(體積比1>∶ 2)、250 μL氯仿和250 μL水,渦旋1.5 min,于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min；轉移有機層至反應瓶,向水層中加入250 μL氯仿，重復提取一次，合并兩次提取液,氮氣吹干,得干燥脂肪酸提取物A。

提取方法②[14]：向血漿質控樣品中加入750 μL氯仿>∶ 甲醇(體積比2>∶1)和200 μL水,渦旋1.5 min,于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min。轉移有機層至反應瓶,向水層中加入500 μL氯仿>∶ 甲醇>∶ 水(體積比86>∶14∶1)重復提取一次，合并兩次提取液,氮氣吹干,得干燥脂肪酸提取物B。

提取方法③[15]：向血漿質控樣品中加入300 μL甲醇、600 μL MTBE和300 μL 0.15 mmol/L醋酸銨,渦旋1.5 min,于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min。轉移有機層至反應瓶,向水層中加入300 μL MTBE重復提取一次，合并兩次提取的有機層溶液,氮氣吹干,得干燥脂肪酸提取物C。

1.4 FFAs衍生化

乙酰氯法[6]：向提取物A中加入200 μL乙酰氯和2 mL甲醇>∶ 正己烷(體積比4>∶1)溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入5 mL 6%碳酸鉀溶液和2 mL正己烷,混勻后轉入離心管,渦旋1 min,于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min,取有機層,氮氣吹干,加入20 μL IS溶液和80 μL正己烷復溶,待測。

硫酸法[16]：向提取物A中加入1 mL 2.5%硫酸-甲醇溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入3 mL 0.9%氯化鈉溶液和2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

鹽酸法[7]：向提取物A中加入1 mL 3 mol/L鹽酸-甲醇溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

三氟化硼法[6]：向提取物A中加入100 μL甲苯和500 μL 14%三氟化硼-甲醇溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入2 mL 0.9%氯化鈉溶液和2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

甲醇鈉法[6]：向提取物A中加入1.25 mL 0.5 mol/L甲醇鈉溶液,密封混勻后于90 ℃反應1 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入1.25 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液,密封,混勻后于90 ℃反應0.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,再加入6 mL 0.9%氯化鈉溶液和2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

直接衍生化法[17]：向干凈反應瓶中加入200 μL乙酰氯、50 μL血漿質控樣品和2 mL甲醇>∶ 正己烷(體積比4>∶1)溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入5 mL 6%碳酸鉀溶液和2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

1.5 GC-MS分析條件

色譜條件：SP-2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm,美國Supelco公司)；升溫程序：起始溫度100 ℃,保持5 min,以4 ℃/min升至240 ℃,保持30 min。進樣口溫度：230 ℃；分流比10>∶1；載氣：氦氣(純度>99.999%)，流量：1.0 mL/min；進樣量：1.0 μL。

質譜條件：EI離子源；離子源溫度250 ℃；接口溫度為230 ℃。溶劑延遲4 min；全掃描(SCAN)模式；質譜掃描范圍：m/z33～450。

圖1 31種 FAMEs和IS標準品的總離子流色譜圖(TIC)Fig.1 Total ion chromatogram of 31 FAMEs and IS standardsthe peak number 1-31 were the same as those in Table 1

圖2 不同衍生化方法對不同FFAs類型含量的影響(n=3)Fig.2 Effects of derivatization methods on the levels of different types of FFAs(n=3)

2 結果與討論

2.1 分析條件的優化

采用分流和不分流進樣對31種FAMEs進行分析,結果顯示:不分流進樣時,溶劑峰嚴重拖尾,無法與C4>∶ 0峰分離,且碳數為12以下的目標物色譜峰嚴重展寬,影響定量。經優化,確定最佳分流比為10>∶1。在此分析條件下31種FAMEs和十九烷酸甲酯(IS)的色譜圖見圖1。由圖可見,31種FAMEs均能被有效分離和檢測,總分析時間為60 min。

2.2 FFAs提取方法的選擇

實驗采用乙酰氯衍生化法考察了3種經典的脂肪酸提取方法對同一血漿樣品中FFAs種類、提取含量及回收率的影響。結果顯示,提取方法①和②均能提取出31種FFAs,而方法③提取了30種FFAs,無法有效提取C18>∶ 2n6t。進一步比較發現,方法①提取的飽和脂肪酸(SFAs)、單不飽和脂肪酸(MUFAs)、多不飽和脂肪酸(PUFAs)和總FFAs(Total FFAs)含量和加標回收率均為最高。因此,本文以方法①提取富集血漿中的FFAs。

2.3 FFAs衍生化方法的選擇

在確定提取方法的條件下,實驗用氯仿>∶甲醇(體積比1>∶2)提取質控樣品中FFAs后,比較了“1.4”所述5種衍生化法對分析結果的影響(圖2)。結果顯示,5種衍生化方法均可獲得31種脂肪酸甲酯,且以乙酰氯法獲得FFAs組含量和加標回收率為最高。進一步比較了“兩步”反應和“一步”反應的衍生化效果,發現兩者均能獲得滿意的加標回收率(>90%),但“兩步”反應所得各FFAs組含量顯著高于“一步”反應。表明“兩步”反應雖然消耗更多的時間和試劑,但能更準確地定量血漿樣品中的FFAs組成,這與Amusquivar等[10]研究結果一致，因此本實驗采用“兩步”反應進行衍生化。

2.4 FFAs衍生化反應溫度與時間的優化

為獲得最優的衍生化溫度和時間,以C13>∶ 0和C23>∶ 0為研究目標,考察了不同反應溫度(40、60、80、90、100 ℃)和時間(0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 h)FFAs甲酯化的影響。結果顯示,C13>∶ 0和C23>∶ 0的衍生化效率隨著反應溫度的升高而逐漸增大,在90 ℃達到最大值,此后升高溫度衍生化效率反而降低；且C23>∶ 0的反應溫度～衍生化效率曲線比C13>∶ 0更陡峭,表明反應溫度對超長鏈FFAs衍生化效率的影響更大。隨著反應時間的延長,乙酰氯對C13>∶ 0和C23>∶ 0的衍生化效率逐漸增大,并在1.5 h達到最大值,繼續延長時間衍生化效率反而逐漸降低。因此,確定乙酰氯衍生化脂肪酸的最佳溫度和時間分別為90 ℃和1.5 h。這與Amusquivar等[10]用乙酰氯在80 ℃下衍生化2.5 h及Liu等[7]用鹽酸-甲醇法在45 ℃下衍生化14 h的方法相比,本研究反應時間更短,更利于大樣本量的檢測。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)在優化條件下,對“1.2”配制的31種FAME混合標準溶液進行測定,以FAME和IS的峰面積之比為縱坐標(Y),對應質量濃度比(X)為橫坐標繪制標準曲線。結果顯示,31種FAMEs在其各自的濃度范圍內線性良好,相關系數(r)不低于0.999 0。以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)分別計算得LOD和LOQ分別為0.010～0.050 μg/mL和0.034～0.167 μg/mL。LOD顯著低于林暉等[16]報道的方法,LOQ低于Giera[18]報道的方法，且所用樣本量(50 μL)比文獻報道[10,16-17](100～200 μL)更少。31種FAMEs的保留時間、線性方程、線性范圍、相關系數(r)、LOD和LOQ等結果見表1。

表1 31種FAMEs的保留時間、線性方程、線性范圍、相關系數(r)、LODs及LOQsTable 1 Retention times,linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of 31 FAMEs

(續表1)

2.5.2 回收率及相對標準偏差以C13>∶ 0和C23>∶ 0為研究目標物質,配制低、中、高(0.16、10、64 μg/mL)3個濃度水平的血漿質控樣品,每個濃度水平平行實驗6次,考察方法的回收率及相對標準偏差(RSD),并連續測定3 d,計算日內及日間RSD。結果表明,C13>∶ 0和C23>∶ 0的回收率為86.3%～115%,RSD(n=6)不大于9.6%,日內RSD(n=6)不大于6.3%,日間RSD(n=3)不大于7.8%,表明該方法準確可靠,精密度良好，均符合2018版FDA生物樣品分析方法驗證指南中對回收率、精密度和準確度的要求[19]。

2.6 實際樣品檢測

取49份健康孕婦血漿樣本在優化條件下測定FFAs含量,結果顯示,與國內外報道相比,本方法可從健康孕婦血漿中檢出更多種類的FFAs(21～31種),最多可檢出31種,其中C11>∶ 0、C17>∶ 1、C21>∶ 0、C22>∶ 0、C22>∶ 1n9和C22>∶ 2在已報道的健康孕婦血漿中未被檢出[20-21]。檢出31種FAMEs的樣品總離子流色譜圖見圖3。孕婦血漿中C16>∶ 0濃度占總濃度比例最大,其次為C18>∶ 2n6c、C18>∶ 1n9c和C18>∶ 0,其余的FFAs占總濃度比例均小于10%(見圖4)。此外,C16>∶ 0(棕櫚酸)和C18>∶ 0(硬脂酸)為動物油中最常見的飽和脂肪酸,C18>∶ 1n9c(油酸)和C18>∶ 2n6c(亞油酸)為植物油中最常見的不飽和脂肪酸,這4種脂肪酸在被檢血漿的FFAs中的構成比例較大,與人體膳食脂肪酸攝入的主要來源是動植物油有關,與Oliveira等[20]報道的結果相近。C18>∶ 3n3(α-亞麻酸)、C20>∶ 5(EPA)、C20>∶ 4n6(花生四烯酸)和C22>∶ 6(DHA)4種具有重要生理功能的多不飽和脂肪酸的含量與國內報道的正常孕產婦臍血中多不飽和脂肪酸含量接近[21]。

圖3 孕婦血漿中31種脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖(TIC)Fig.3 Total ion chromatogram of 31 fatty acid methyl ester in pregnant woman's plasmathe number 1-31 were the same as those in Table 1

3 結 論

本文通過比較不同提取方法和衍生化方法對血漿中FFAs定性定量的影響,確定了以氯仿>∶ 甲醇(體積比1>∶2)提取血漿中的FFAs,乙酰氯法衍生化,建立了血漿中FFAs含量的氣相色譜-質譜測定方法。方法可用于血漿中31種FFAs的準確定性和定量,具有靈敏、穩定、可靠、所需樣本量少以及可獲得血漿中更多FFAs信息等優點。將該方法應用于測定孕婦血漿中的FFAs組成和含量,從而獲得較全面、準確可靠的FFAs代謝譜信息。研究結果既可反映孕婦膳食結構,又能反映其代謝情況,可為下一步制訂和調整孕期膳食營養提供科學依據。