超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定化妝品中35種性激素

胡 貝，李麗霞，劉 紅，楊飄飄，李曉健，黃 偉，丁曉萍

(1.湖北省藥品監督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省藥品質量檢測與控制工程技術研究中心，湖北 武漢 430075)

性激素是一種類固醇激素，包括雄激素、孕激素和雌激素[1]，其主體結構為環戊烷并多氫菲核，不同化合物間的差別是環上碳原子所連的基團不同[2-3]。它不僅具有控制性器官和第二性征的作用[4-5]，還參與人體內脂肪、蛋白質、糖分、無機鹽等生命基本物質的代謝活動[4]，是影響生殖健康的重要因素[6]。當添加性激素的化妝品直接作用于皮膚上，短期內可見促進乳腺發育、增加毛發生長等作用，但長久使用會造成色素沉積、發育異常及人體代謝紊亂等副作用，甚至有致癌性[4,7]。我國《化妝品安全技術規范》(2015年版)[8]和歐盟化妝品法規(Council Directive 76/768/EEC)[9]均將性激素列為禁用組分。

目前化妝品中性激素的分析方法有液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質譜法[8]、液相色譜-質譜法[12-18]、聚合物整體柱微萃取-高效液相色譜法[19]、固相萃取-微乳液相色譜法[20]、凝膠滲透色譜-液相色譜-串聯質譜法[21]、超高效合相色譜法[22]等。其中，超高效液相色譜-串聯質譜法因具有分析時間短、靈敏度高、特異性好等優點，已成為近年來化妝品中禁用組分分析的首選方法。《化妝品安全技術規范》(2015年版)中 ，采用高效液相色譜法及氣相色譜-質譜法測定雌三醇等7種組分，其中高效液相色譜法雖前處理步驟簡便，但無質譜確證，可能造成假陽性，而氣相色譜-質譜法需衍生化，操作繁瑣、耗時；新增標準采用液相色譜-串聯質譜法檢測化妝品中的63種激素類成分，其中僅包括13種性激素。林志惠等[12]、李晶瑞等[13]、鄭利等[17]利用固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜分別建立了同時測定化妝品中21種、15種和3種性激素的方法，陳少波等[14]運用QuEChERS-高效液相色譜-質譜聯用建立了快速篩查化妝品中112種禁用藥物(含4種性激素)的方法，岳磊等[15]、茹歌等[16]運用超高效液相色譜-質譜聯用分別建立了同時測定化妝品中5種和13種性激素的方法，劉齊等[18]運用高效液相色譜-質譜聯用建立了同時測定育發液中9種禁限用物質(含7種性激素)的方法。而我國實際生產并使用的性激素高達幾十種[4]，故現行標準方法及文獻報道方法可同時檢測的性激素種類仍較少，可能存在不法商家為規避執法添加法定檢測組分以外的性激素的違法行為。綜上所述，建立一種前處理方法簡便省時、適應性良好、涵蓋性激素種類多、定性定量準確的檢測方法成為亟待解決的問題。

本文以液體水基類、乳液類、膏霜類化妝品為研究對象，通過對提取溶劑、提取方式和提取時間等參數的優化，建立了可快速同時測定化妝品中35種性激素的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法。本方法可分析的性激素種類多于現有國家標準及文獻報道，且前處理步驟簡便、靈敏度高、準確性好，能滿足高效率日常監督抽檢的需要，可為化妝品中性激素檢測方法的國家標準制修訂提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQ-S質譜儀(美國Waters公司)；ST16臺式離心機(德國Thermo Fisher Scientific公司)；LC-250型超聲波清洗器(山東濟寧魯超超聲設備有限公司)。

群勃龍(純度96.3%，下同)、勃地酮(98.8%)、諾龍(96.7%)、氧甲氫龍(99.0%)、睪酮(99.2%)、21-羥基孕酮(99.8%)、甲睪酮(97.7%)、雄烯二酮(99.3%)、17-α-羥基孕酮(99.5%)、氯司替勃(99.5%)、甲羥孕酮(99.0%)、孕酮(99.7%)、醋酸美倫孕酮(97.7%)、醋酸甲羥孕酮(99.0%)、醋酸氯睪酮(97.0%)、丙酸睪酮(99.7%)、雙酚A(99.8%)、17-β-雌二醇(95.4%)、17-α-雌二醇(99.3%)、雌酮(99.6%)、己烯雌酚(97.4%)、雙烯雌酚(96.6%)、己烷雌酚(99.14%)均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；炔諾酮(99.4%)、孕三烯酮(99.7%)、孕二烯酮(99.4%)、達那唑(99.2%)、醋酸氯地孕酮(100%)、己酸羥孕酮(99.8%)、苯丙酸諾龍(99.1%)、雌三醇(97.6%)均購于中國食品藥品檢定研究院；腎上腺甾酮(98%)、美雄酮(95%)均購于Toronto Research Chemicals公司；表睪酮(1 mg/mL)購于Cerilliant公司；炔諾孕酮(100%)購于European Pharmacopoeia公司；甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；實驗用水為一級水(由美國密理博公司Milli-Q超純水機制備)。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為水；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣體積為2 μL。梯度洗脫程序：0～13 min，5%～35% A；13～14 min，35% A；14～15 min，35%～48% A；15～17 min，48% A；17～24 min，48%～85% A ；24～26 min，85% A；26～27 min，85%～5% A；27～31 min，5% A。

1.2.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI+和ESI-)；掃描模式：多反應監測(MRM)；正離子噴霧電壓：3.2 kV；負離子噴霧電壓：2.8 kV；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；進樣錐氣體流速：150 L/h。35種性激素的質譜參數見表1。

表1 35種性激素的質譜參數Table 1 MS parameters of 35 sex hormones

1.3 樣品前處理

稱取均勻試樣0.2 g(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，加入2 mL乙腈，在渦旋儀上分散(水狀樣品渦旋1 min，乳狀樣品和霜狀樣品均渦旋2 min)，然后加入50%乙腈水溶液至近刻度，超聲提取20 min后取出。待樣品恢復至室溫后，用50%乙腈水溶液定容至刻度，搖勻，8 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，上機測定。

1.4 系列基質標準曲線溶液的配制

標準儲備溶液：準確稱取各標準品約10 mg(精確至0.01 mg)分別置于不同的10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，搖勻即得質量濃度約為1 mg/mL的各性激素標準儲備溶液。

混合標準溶液：精密量取適量各性激素標準儲備溶液置于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻即得質量濃度約為1 mg/L的混合標準溶液。

分別取水狀、乳狀、霜狀基質空白樣品各7份于10 mL容量瓶中，每份0.2 g(精確至0.000 1 g)，分別加入混合標準溶液適量，按“1.3”步驟進行前處理，即得質量濃度分別約為2、4、10、20、30、40、50 μg/L的系列基質標準曲線溶液。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇根據文獻報道[10-17]，本實驗考察了甲醇、乙腈、90%甲醇水溶液、50%甲醇乙腈和50%乙腈水溶液5種提取溶劑的效果。稱取15份均勻的空白水狀樣品(每份約0.2 g)，分為5組(每組平行3份)，分別加入適量的混合標準溶液，使樣品中各性激素的加標量均為1.00 μg/g，分別采用上述提取溶劑進行提取，其他操作按“1.3”進行前處理，計算樣品的加標回收率。結果表明，采用甲醇、乙腈、90%甲醇水溶液、50%甲醇乙腈和50%乙腈水溶液作為提取溶劑時，35種性激素的加標回收率分別為73.7%～114%、68.4%～113%、73.5%～118%、77.4%～118%和81.4%～118%，相對標準偏差(RSD)分別為0.40%～8.1%、0.50%～8.7%、0.90%～10%、0.50%～10%和1.1%～9.5%。由于50%乙腈水溶液作為提取劑時35種性激素的回收率最好且RSD滿足分析要求，因此選擇提取溶劑為50%乙腈水溶液。

2.1.2 提取方式及提取時間的選擇分別考察了超聲、渦旋和振蕩3種方式的提取效果。稱取9份均勻的空白水狀樣品(每份約0.2 g)，分為3組(每組平行3份)，分別加入適量的混合標準溶液，使樣品中各性激素的加標量均為1.00 μg/g，分別采用上述提取方式進行提取，其他操作按“1.3”進行前處理，計算樣品的加標回收率。結果表明，采用超聲、渦旋和振蕩方式進行提取時，35種性激素的加標回收率分別為87.0%～115%、84.3%～116%和80.9%～116%，RSD分別為2.7%～8.7%、1.3%～8.0%和0.60%～10%。超聲提取的回收率總體較好，且簡便易操作，因此進一步同法考察了超聲提取時間分別為10、20、30 min時35種性激素的回收率。結果顯示，超聲時間為10、20、30 min時，35種性激素的加標回收率分別為76.4%～114%、89.7%～111%和84.6%～112%，RSD分別為0.50%～8.3%、0.10%～13%和0.20%～13%。超聲提取時間為20 min時的回收率最高。綜上，實驗選擇超聲提取20 min。

2.2 色譜條件的優化

考察了CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)3種色譜柱的分離效果。結果表明，在同等色譜條件下，35種性激素在CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)柱上的峰形對稱、尖銳，各母離子、子離子相同或相近的組分(表1中組分1和5、3和13、7和15、9和14、18和25、30和31、32和35)均能實現良好分離，可以準確定性、定量。因此，選擇CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)柱進行分離。

2.3 質譜條件的優化

采用直接灌注的進樣方式，在正、負離子掃描模式下，對各性激素進行全掃描，得到其母離子后，采用二級質譜掃描確定各性激素的子離子，并進一步優化其錐孔電壓(CV)和碰撞能量(CE)。優化的質譜條件見“1.2.2”，此條件下35種性激素的穩定性好，靈敏度高，其MRM圖見圖1。

2.4 線性范圍與檢出限

根據《化妝品安全技術規范》(2015年版)[8]及文獻報道[16]，選擇配制系列基質標準曲線溶液以消除基質效應的干擾。在優化條件下，以定量離子對的峰面積為縱坐標(y)，對應質量濃度為橫坐標(x,μg/L)繪制基質標準曲線，并以3倍信噪比計算方法檢出限(LOD)，10倍信噪比計算方法定量下限(LOQ)。結果表明，35種性激素在一定的質量濃度范圍內線性良好，相關系數(r)均大于0.99，LOD為0.028～0.117 μg/g，LOQ為0.093～0.352 μg/g(見表2)。

圖1 35種性激素的UPLC-MS/MS MRM譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS MRM chromatograms of 35 sex hormonesthe numbers denoted(1-35) were the same as those in Table 1

2.5 加標回收率與相對標準偏差

稱取水狀、乳狀、霜狀3種基質均勻空白樣品各18份(每份約0.2 g)于10 mL容量瓶中，分為3組(每組平行6份)，分別添加適量混合標準溶液，使3組樣品中各組分的加標量分別為0.25、0.50、1.00 μg/g，按“1.3”處理樣品并進行加標回收實驗。結果表明，水狀、乳狀基質樣品的加標回收率分別為84.5%～112%和84.0%～116%，RSD分別為1.7%～11%和1.5%～12%；霜狀基質樣品的加標回收率為84.0%～117%，RSD為2.1%～14%(見表2)。該方法回收率和重現性良好，準確性高，適應性好，可作為化妝品中35種性激素的檢測方法。

表2 35種性激素的線性范圍、檢出限、定量下限及霜狀樣品的加標回收率、相對標準偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,LODs,LOQs of 35 sex hormones and spiked recoveries,RSDs(n=6) of cream sample

2.6 實際樣品的測定

為評價方法的適用性，采用該方法對日常監督抽檢中的15批化妝品(含水狀、乳狀、霜狀化妝品各5批)進行了測定，結果均為未檢出，樣品中的雜質峰對目標峰均無干擾，可準確定性、定量。使用本方法進行測定，前處理時間約1 h，上機分析時間為31 min，相較于其他分析方法更適合化妝品中多種性激素的快速篩查。

3 結 論

本文建立的同時測定化妝品中35種性激素的超高效液相色譜-串聯質譜法，相較于《化妝品安全技術規范》(2015年版)及文獻報道中性激素的檢測方法，增加了性激素的檢測種類，且前處理簡便快捷、分析時間短、適應性強，適應于現今高效日常監管的理念，可為化妝品中35種性激素的大批量日常監督抽檢和國家標準的制修訂提供科學依據。