響應曲面法優化壁虎水溶性蛋白的提取工藝

張荳，宋肖樺，胡慧華

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

壁虎又名守宮、天龍、蝎虎等，為壁虎科動物無蹼壁虎GekkoswinhonisGüenther、多疣壁虎G.japonicusDumeril et Bibron或蹼趾壁虎G.subpalmatusGüenther等的全體，寒，咸，有小毒，具有祛風定驚、解毒散結的功效[1]，主治中風癱瘓、手足不舉、歷節風痛、風痙驚癇、小兒疳痢、疬風瘰疬、血積成痞，療蝎螯等。目前國內外眾多學者致力于研究壁虎抗腫瘤活性物質、藥理作用，已有研究表明，壁虎多肽及蛋白質組分可顯著抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導細胞凋亡[2-4]。因此優化壁虎蛋白質的提取工藝對于進一步的藥理作用研究具有重要意義。壁虎藥材尚未載入2015年版《中華人民共和國藥典藥典》，各地方標準對其質量要求也無明確規定。因此，對蛋白質含量的定量控制也是確保壁虎藥材療效的一個有效手段[5]。

正交試驗法優化雖然能通過研究多種因素，減少實驗次數，最終找出最佳因素水平組合，但卻不能從整個區域中計算出單因素和指標間確定的函數表達式即回歸方程，并且不能探討單因素之間的交互作用[6]，因此，建立的數學模型預見性、重復性差。Box-Behnken響應曲面法因其可以準確表達單因素與指標之間的關系，已被廣泛用于各行業工藝的優化[7]。本實驗擬通過單因素試驗與響應面分析法設計篩選壁虎蛋白質的提取工藝，以期為中藥壁虎水溶性蛋白質的提取工藝研究、質量標準制訂以及抑制腫瘤研究方面提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-P7型紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；101-2AB型烘箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SB25-12DTD型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HC-3518型離心機(安徽省中科中佳科學儀器有限公司)；HC-300T固體粉碎機(永康市天祺盛世工貿有限公司)；FA1104B型萬分之一電子天平(上海越平科學儀器有限公司)。

1.2 試藥

牛血清白蛋白(BSA，北京索萊寶科技有限公司，批號：920T053)；所用試劑均為分析純；水為去離子水。

生品壁虎產自安徽，經北京中醫藥大學胡慧華副教授鑒定為壁虎科動物無蹼壁虎GekkoswinhonisGuenther的干燥全體。

2 方法與結果

2.1 供試品的制備

2.1.1對照品溶液的配制 精密稱取 BSA標準品10 mg，用去離子水溶解并定容至100 mL，即得0.1 g·L-1的BSA標準溶液，備用。

2.1.2考馬斯亮藍染液的配制 精密稱取100 mg考馬斯亮藍，溶于50 mL 90%的乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，后用去離子水定容至1000 mL，置燒杯中，超聲4 h，定量濾紙過濾[8]，即可置4 ℃冰箱中備用。

2.1.3標準曲線的制備 精密量取BSA標準溶液0、0.1、0.3、0.6、0.8、1 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，補加去離子水至 1 mL，制成不同濃度的BSA溶液。然后分別加入5 mL考馬斯亮藍染色溶液，染色5 min，搖勻。以第1份不含對照品溶液作為空白對照，595 nm為檢測波長，檢測對照品溶液的吸光度，以蛋白質含量(X)為橫坐標，以吸光度(Y)為縱坐標，進行線性回歸分析。線性回歸方程為Y=9.853 7X+0.097 4，r=0.999 9，結果表明，0～100 μg線性關系良好。

2.1.4樣品的配制

2.1.4.1藥材預處理 將藥材粉末(過四號篩)置于干燥器內干燥12 h后，包于濾紙包內，用石油醚索氏提取10 h[9]。待藥渣揮干石油醚后收集，以備提取可溶性蛋白。

2.1.4.2供試品溶液的配制 精密稱取預處理后的藥材粉末0.72 g(相當于索氏提取脫脂前1 g)，在考察提取因素條件下(超聲時間、超聲溫度、pH、料液比)超聲提取，5000 r·min-1離心(離心半徑8.8 cm)15 min，取上清液作為待測溶液，每個處理重復3次。分別吸取一定量的待測溶液，測定吸光度，按2.1.3項下BSA回歸方程計算中藥壁虎中水溶性蛋白的含量。

2.2 單因素試驗

2.2.1超聲提取時間對壁虎水溶性蛋白含量的影響

精密稱取預處理后的藥渣粉末0.72 g(相當于脫脂前的藥材粉末質量1 g)于100 mL錐形瓶中，以去離子水(pH為6.8)20 mL為提取溶劑，固定超聲提取溫度為50 ℃，料液比為1∶20，分別考察超聲時間10、20、40、60、80、100 min時壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，見圖1。

圖1 不同提取時間對蛋白質含量的影響

從圖1可以看出，壁虎可溶性蛋白的含量隨提取時間的延長呈現先上升后下降趨勢，當超聲時間為10～80 min時含量呈現上升趨勢；當超聲時間為80～100 min時含量呈現下降趨勢。綜上所述，可以確定提取時間為80 min時提取率最高。因此本研究在響應曲面提取時間因素的3個水平選擇提取率較高的60、80、100 min。

2.2.2不同料液比對壁虎水溶性蛋白含量的影響 精密稱取壁虎預處理后的藥渣粉末0.72 g(相當于脫脂前的藥材粉末質量1 g)，以去離子水(pH為6.8)為提取溶劑，固定超聲提取溫度為50 ℃，超聲時間為20 min，分別考察料液比1∶5、1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶100時壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，見圖2。

圖2 不同料液比對蛋白質含量的影響

從圖2可以看出，隨著料液比的增加，壁虎藥材可溶性蛋白的含量呈現先上升后下降的趨勢，當料液比在1∶5～1∶50時蛋白質含量呈現上升趨勢；當料液比在1∶50～1∶100時蛋白質含量呈現下降趨勢。綜上所述，可以確定料液比為1∶50時提取率最高。因此本研究在響應曲面料液比因素的3水平選擇提取率較高的1∶30、1∶50、1∶70。

2.2.3不同pH對壁虎水溶性蛋白含量的影響 精密稱定壁虎預處理后的藥渣粉末0.72 g(相當于脫脂前的藥材粉末質量1 g)，固定超聲提取溫度為50 ℃，超聲時間為20 min，料液比為1∶20，分別考察加入去離子水(調pH分別為3、5、7、9、11、13)20 mL時壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，見圖3。

圖3 不同pH對蛋白質含量的影響

從圖3可以看出，堿性條件下，壁虎藥材可溶性蛋白提取率顯著高于酸性和中性條件下，并且隨著pH的升高，提取的蛋白質含量顯著增加，這可能因為壁虎含有較多的堿性氨基酸，隨著pH的升高，大量氨基酸在等電點附近沉淀析出。綜上所述，可以確定pH 14時蛋白質含量最高，因此本研究在響應曲面pH因素的三因素選擇12、13、14。

2.2.4不同溫度對壁虎水溶性蛋白含量的影響 精密稱定壁虎預處理后的藥渣粉末0.72 g(相當于脫脂前的藥材粉末1 g)。以去離子水(pH為6.8)20 mL為提取溶劑，固定提取時間為20 min，料液比為1∶20，分別考察20、30、40、50、60、70、80 ℃時壁虎中水溶性蛋白的提取率(n=3)，見圖4。

圖4 不同溫度對蛋白質含量的影響

從圖4可以看出，隨著溫度的增加，壁虎可溶性蛋白提取率呈現先上升又下降又上升的趨勢，但整體變化趨勢不明顯，同時考慮到超聲提取時，溫度不易控制，因此不將溫度納入壁虎蛋白提取工藝的考察范圍之內。

2.3 Box-Behnken響應面試驗設計

2.3.1響應模型建立與分析 在單因素考察的基礎上，確定提取時間、料液比、pH 3個因素，運用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型設計試驗組，將壁虎水溶性蛋白含量作為指標，進行響應曲面分析。因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 壁虎中水溶性蛋白提取工藝響應面試驗因素水平

表2 壁虎中水溶性蛋白提取工藝響應面實驗設計與結果

表3 壁虎中水溶性蛋白提取工藝響應面方差分析

對所記錄的數據進行回歸分析，得出料液比(A)、pH(B)和提取時間(C)3個因素對壁虎水溶性蛋白含量影響的二次多項回歸方程：Y=189.27+54.78A+60.29B+4.59C+27.84AB+4.37AC-6.32BC-1.41A2-60.08 B2-10.24C2。從表3方差分析可知，該模型差異有統計學意義(P<0.001)，決定系數R2=0.980 5，表明所得值與預測值擬合程度良好。失擬項P為0.053 5(>0.05)，說明失擬項差異無統計學意義，表明未知因素干擾小。

結果表明該回歸方程模型擬合度良好，實驗誤差小，能夠精準反映A、B、C 3個因素對壁虎水溶出蛋白質含量的影響，因此壁虎水溶性蛋白提取工藝的優化可以采用此模型?；貧w方程的顯著性表明：一次項回歸方程中，A、B差異有統計學意義，對蛋白質含量的影響較大，而C差異無統計學意義；在交互項中，AB交互項差異有統計學意義，而其他2個交互項差異無統計學意義。在二次項中，B2差異有統計學意義，其他2項差異無統計學意義。綜上所述，3個因素水平對蛋白質含量的影響依次為：B>A>C。

2.3.2響應曲面圖直觀分析 圖5～7為3個因素之間的三維曲面圖和二維平面等高線圖，從圖中可直觀得出因素之間的交互作用以及交互對蛋白質含量的影響。

圖5 料液比和pH對蛋白質提取影響的等高線圖和響應曲面圖

圖6 料液比和提取時間對蛋白質提取影響的等高線圖和響應曲面圖

圖7 pH和提取時間對蛋白質提取影響的等高線圖和響應曲面圖

圖5、7中響應面圖pH坡度較陡，均表明pH對壁虎蛋白質提取的影響較大，圖6中，料液比和提取時間的響應面坡度較平緩，表明兩者對壁虎蛋白質提取的影響不大。同時表明以上響應面圖分析結果與方差分析結果相符。

2.3.3驗證實驗 根據單因素實驗和二次回歸模型總和分析，在Design-Expert 8.0.6軟件中，選擇目標為水溶性蛋白含量最大值，預測得到最優提取工藝參數：料液比為1∶70，提取時間為84.33 min，pH為13.72。在此條件下，蛋白質質量分數的預測值為275.431 mg·g-1。為了驗證實驗結果的可靠性，要對模型的提取工藝進行驗證。結合實驗的可操作性，將蛋白質的提取工藝參數調整為：料液比為1∶70，提取時間為84 min，pH為14。

應用此工藝條件進行3次平行驗證實驗。結果壁虎藥材中總水溶性蛋白平均質量分數為272.92 mg·g-1，與預測值275.431 mg·g-1相比，RSD為0.54%，表明該響應曲面方法得到的回歸模型與實際情況擬合很好，該模型可以很好預測壁虎蛋白質提取含量。

3 討論

我國是原發性肝癌發病率和病死率均較高的國家，壁虎多肽活性組分能夠抑制肝癌細胞的生長和增殖[10-12]，壁虎在民間更是被稱為“抗腫瘤之星”。但壁虎經常被當做蛤蚧的混淆品入藥。隨著壁虎被現代藥理研究和臨床應用，其優點被更多人所發現，今已廣泛治療臨床多種疾病[5]。壁虎藥材的傳統炮制方法是用竹片貫穿頭腹，將尾用繩固定于竹片上撐開，然后用微火烤干或陰干。在炮制過程中可能會導致蛋白質和酶等活性物質的破壞?，F有研究表明，壁虎多肽及蛋白質組分是其抗腫瘤作用的重要活性成分。因此，蛋白質含量的定量測定可作為壁虎藥材質量評價的一個重要指標。

響應曲面法具有精度高，預測性好的優點[13]，能夠快速得出工藝中多因素影響的最佳條件。本試驗首先進行了單因素試驗，然后采用Box-Behnken響應曲面法試驗進行壁虎水溶性蛋白的超聲提取工藝優化，建立的二次多項回歸模型顯著性良好，能夠準確地反映3個因素對壁虎水溶性蛋白含量的影響。壁虎水溶性蛋白超聲提取最佳條件：料液比為1∶70，提取時間為84 min，pH為14，蛋白質質量分數為275.431 mg·g-1，通過驗證實驗可知，所采用的響應面法優化理論與試驗值相近，結果可靠。