生物強化技術及其在污水處理中應用研究評述

王亞軍，蔡文娟，王惠

1. 蘭州理工大學土木工程學院，甘肅 蘭州 730050；2. 蘭州興蓉環境發展有限責任公司，甘肅 蘭州 730070

生物處理法在污水處理系統中處于主導地位，微生物對生物處理效果優劣起著至關重要的作用，如果污水中存在難降解有毒物質則可能抑制微生物的生長代謝，外界環境變化也可能會使微生物活性受到抑制，最終導致處理效果不佳、出水水質不達標，因此生物處理方法在實際生產應用中也存在著自身的局限性，而生物強化技術便是在這樣的背景下應運而生。

生物強化技術是指在傳統的生物處理系統中，通過引入具備特定功能的微生物，使系統對于特定污染物的降解能力和降解效率都有所提高，且達到有效處理含難降解有機污染物污水目的（郭靜波，2010）。具有幾點優勢：對難降解污染物質的去除效果良好，生物強化技術中所采用的微生物是經過一定條件的馴化選擇培養而得到的，因此對于特定污染物具有很強的專一性；減少系統剩余污泥量；維持系統運行穩定性；增強抵抗外界環境和污染物質濃度變化帶來的沖擊負荷；縮短系統啟動時間。

近年來通過生物強化技術處理各類污染物的應用已經屢見不鮮，通常用于工業廢水處理中，主要是因為該技術對于工業廢水中的某種特定的難降解污染物具有較好的降解效果，而且成本較之原有工藝的改造更加低廉有效，從而使得生物強化技術的研究更加普遍。生物強化技術在城市污水處理中的應用并不廣泛，主要是由于早期城市污水水質組分簡單，污染物質的構成并不是復雜且難于降解，所以只需應用傳統生物法進行處理便可以使得尾水達標。但是，隨著社會發展和人們對水質要求提高，城市生活污水成分中已經常含有大量油脂、表面活性劑和重金屬離子等，若僅僅依靠傳統的土著微生物進行生物處理，已無法保證尾水達標，因此，具有多種優勢的生物強化技術理所當然地拓展到城市生活污水處理領域。

1 生物強化技術的發展

20世紀 90年代生物強化技術應用于各個領域的案例就已經出現，Goulding et al.（1988）研究了在垃圾處理的系統中引入對芳香族化合物具有高效降解功能的微生物可以使各類芳香族化合物得到降解，文中也提到由于自然界中的土著微生物不具備降解人工合成化合物的能力。Mikesell et al.（1988）通過向受五氯苯酚污染的土壤中投入具有脫氯酚能力的厭氧污泥，發現土壤中的五氯苯酚得到了更好的去除。在1992年Stephenson et al.（1992）闡述了強化菌劑的制作方法、應用手段以及效果評價。

進入 21世紀，基因工程菌和質粒接合研究推動了生物強化技術發展，Jin et al.（2009）采用一株基因工程菌對印染廢水進行脫色，實驗發現經過生物強化可以增強廢水中的生物活性，其反應器在適宜的環境下對廢水的脫色效果更加良好。Mohan et al.（2009）將假單胞菌中具有降解甲苯和苯甲醇能力的質粒接合到受體菌株中，以此獲得的優勢菌株對上述的兩種污染物都具有很好的降解效果。劉春等（2008）考察了一株對降解阿特拉津具備降解功能的基因工程菌分別在MBR和CAS中的流失情況以及流失后在模擬自然環境中的生存狀況，結果表明當基因工程菌流入適宜生存的土壤環境中時，會增加潛在的生態風險。郭靜波等（2011）闡述了生物強化技術在污水處理中的作用機制、作用效果和研究狀況，系統總結出生物強化的作用機制是通過一定的生物技術手段如篩選、馴化和基因重組等將得到的可以降解目標污染物的高效降解菌直接投入到污水中，菌種以游離或者附著在載體上以生物膜的形式對污水目標污染物起到降解作用，同時在復雜的生物處理系統中可能存在微生物的共代謝作用。

2 生物強化技術的概述

2.1 生物強化技術的作用機理

2.1.1 高效菌的直接作用

自然界中某些微生物細胞中攜帶特殊性質的質粒，如攜帶抗藥性質粒的微生物細胞具有耐或抗或分解或失活某種抗生素或藥物的作用，還有些微生物攜帶抗重金屬、紫外線等的質粒；或者攜帶降解質粒，可以降解某種化合物。而這些特殊功能都為生物強化技術的誕生、應用與發展提供了有利的基礎條件。多種研究結果發現酶、蛋白質、細胞膜、細胞質等微生物細胞結構使生物強化技術的原動力。

Shi et al.（2012）將嗜鹽微生物接入到高鹽度廢水中對廢水中的營養物質進行去除，處理效果要比未接入嗜鹽微生物的對照反應器要好，而對于生物濾池反沖洗后的恢復時間也相應得到了縮短。Cui et al.（2014）運用生物強化技術對低溫環境下中高濃度城市污水進行處理，對于COD、氨氮等物質的去除效果都要比非生物強化反應器的好，且微生物種群更加多樣，反應器的啟動時間也得到大大縮減。低溫菌細胞內的酶蛋白在低溫環境下也可以正常發揮其自身的作用，并且還具有很高的活性（辛明秀等，2000）。低溫酶在低溫環境中的比活力較高，而由于酶蛋白分子具有很好的柔性，可以形成相對松散且具有彈性的結構，增強了對底物的作用，加快了酶促反應的進行，使得低溫酶具有很高的催化活性（Marx et al.，2007）。也有研究者發現嗜冷菌在低溫環境下生長時，可以產生這種冷適應蛋白（CAP）來適應外界環境溫度的波動（韓曉云，2006）。抗凍蛋白（AFP）表面與冰晶結合可以產生“熱滯后”的現象，可以使得適冷微生物在低溫環境中生長（邱天等，2012）。嗜冷微生物具有較高含量的不飽和脂肪酸，降低脂肪酸的碳鏈長度，增加甲基支鏈脂肪酸都是有利于低溫菌在低溫環境下的生存（Chattopadhyay et al.，2001）。嗜冷微生物可以產生冷凍保護劑對細胞起到保護作用，可維持細胞正常的滲透壓（林學政等，2003）。Bhattacharya et al.（2013）研究一株耐鉻菌株對六價鉻的耐受能力發現耐鉻菌株對金屬 Cr(VI)、Zn(II)、Pb(II)、Ni(II)、Cd(II)都具有耐受性，通過使用酶將Cr(VI)轉化成毒性較低的Cr(Ⅲ)、吸附和細胞內的積累作用。Tsutsui et al.（2013）運用水平基因轉移的技術將具有可以降解 2, 4-二氯苯氧乙酸的質粒 pJP4接合到兩株受體菌株的細胞中，生物強化的兩個反應器對目標污染物的降解能力要比對照組的效果好而且可以承受高負荷目標污染物的沖擊，質粒對于受體細胞的選擇會影響反應器的性能。水平基因轉移技術是通過能夠在DNA分子內部或之間移動的可移動遺傳元件的協同活動來完成的，這些可移動遺傳元件包括質粒、轉座子、整合子、插入序列共同區等（Partridge et al.，2018）。降解質?？梢酝ㄟ^接合作用進行轉移而發生重組，從而使得微生物具備對結構復雜、難降解和穩定化合物的降解能力（Top et al.，2002）。

上述內容詳細地介紹了耐鹽微生物、耐冷微生物、耐鉻微生物以及可降解2, 4-二氯苯氧乙酸微生物的分子機理，表1列舉了幾種難降解有機污染物高效降解菌。

生物強化過程中的微生物主要是依據污染物特定的物理化學性質所篩選出來的，這些微生物要比普通微生物對于目標污染物的降解效果更好，而且通過固定化技術將選定的微生物固定到生物膜中以防止微生物被沖洗掉，能達到更高的效果。而具備生物強化作用的微生物一般需要滿足 3個條件：（1）可以在特定環境中生存；（2）具備很強的競爭能力；（3）可以和其他土著微生物共存（Wang et al.，2009）。從上述例子中可以看出不同微生物對于不同目標污染物質的降解機制也是不同的，這主要取決于微生物細胞分子對環境的適應機制。生物強化技術應用最為普遍的方式是針對目標污染物質或者環境條件等因素篩選出高效菌種，并直接進行投加，利用微生物本身所具備的作用機制對污染物達到高效的處理效果。

表1 難降解有機污染物高效降解菌Table 1 The highly degradable bacteria for refractory organic pollutants

2.1.2 共代謝作用

共代謝作用是大多數微生物降解環境中有機污染物的一種重要方式，它是微生物為適應復雜的環境條件而長期進化形成的一種特性，也是微生物的一種重要的代謝機制。共代謝是指微生物在利用易降解的物質作為碳源或能源的同時，對目標污染物進行降解的過程（張慶云等，2017a）。Lu et al.（2016）在利用光合細菌降解淀粉的過程中發現光合細菌不能直接降解高分子多糖，從而使得淀粉降解過程受阻，但是當加入蘋果酸作為初級基質，由于共代謝作用使淀粉得到高效的降解。對于共代謝的作用機制，主要包括以下 3種情況：（1）微生物在代謝生長基質的過程中對非生長基質的轉化；（2）微生物的種間協同作用降解有機污染物；（3）生長基質不存在時休眠細胞對非生長基質的代謝（羅瑋，2012）。

影響共代謝過程的關鍵因素有關鍵酶活性的維持、生長基質與目標污染物的競爭與抑制、目標污染物濃度及其對微生物的毒性作用（Zhou et al.，2011）。表2總結了一些具有共代謝功能的微生物。

2.1.3 群體感應作用

群體感應是微生物為方便它們之間的信息交流而自發產生和釋放的一些被稱為自誘導物質的信號分子，這些自誘導物質可以調控微生物的群體行為并且有利于生物膜的形成，從而使得微生物群落增加，在生物強化過程中，整個微生物群落結構的變化也可能是由高效菌株的群體感應能力所引起的（Zhang et al.，2017）。生物膜形成的其中一種機制是群體感應，微生物通過信號分子來調節種群附著和遷移，以此形成生物膜（溫東輝等，2014），前文已經論述了水平基因轉移主要是依靠某些微生物自身攜帶有可降解目標污染物的可移動遺傳元件起作用，S?ren et al.（2003）提出基因轉移可能加速微生物群落自身的生理性能和分解代謝性能，而生物膜中密實的種群結構通過接合可以提高質粒的擴散和基因的釋放。同時生物膜的形成也有利于微生物在生物處理系統中的固定化作用，從而有助于改善生物強化處理廢水的效果。因此，微生物群體感應可以通過刺激生物膜的生長達到污染物的降解作用（Alexis et al.，2016；Chen et al.，2018）。雍陽春（2010）通過篩選得到一株具有AHL群體感應系統且有較強芳香族污染物降解能力的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CGMCC 1.860，對其降解特性進行研究分析得出外源添加的短鏈 AHL能夠提高銅綠假單胞菌的苯酚降解能力并且群體感應系統在該過程中對生物降解具有調控作用。

表2 具有共代謝功能的微生物Table 2 The microorganisms with co-metabolic function

2.2 高效菌株的獲取方式

生物強化技術的實施步驟關鍵是獲得具有特定降解功效的微生物，這些微生物主要來源以下 3方面：

2.2.1 從自然界中直接進行篩選

現階段從自然界中通過選擇培養是獲取高效菌株最普遍的方法，即在受污染環境或者在自然環境下對功能性不同的微生物進行分離篩選以獲得高效降解功能的菌株。近些年來，隨著現代生物技術的發展，國內外學者對于優勢菌株高效快速的篩選技術也進行了深入的研究，高通量篩選技術是目前較為先進的優勢菌株篩選方法，應用高通量篩選技術可以快速獲得理想的實用菌株，有效降低菌株篩選的時間和成本。

2.2.2 基因工程菌的構造

通過把對特定污染物具有降解功能的目的基因導入到受體菌株的細胞內并使其表達，從而構建出人類所需要的菌株，以實現對環境中難降解污染物質的高效降解作用。應用基因工程技術構建高效菌的途徑主要有質粒的轉移過程、原生質的融合過程、基因重組過程和改變胞內關鍵酶系統的過程。

2.2.3 水平基因轉移

在不同菌種之間，遺傳物質也可以通過水平基因轉移技術進行傳遞，楊懿寧等（2015）闡述這 3種高效菌株的獲取方式，運用常規手段分離出的高效降解菌種可能存在對各種環境、有毒物質耐受力不足的問題，但是其技術成熟、應用范圍廣。應用基因工程技術構造出的菌株對目標污染物降解效率穩定，并且針對性較好。水平基因轉移技術獲取的菌株在處理系統中處于優勢地位，可以保持高數量和高活性。而目前基因工程菌的構造和水平基因轉移技術都存在生物安全性方面的爭議。

2.3 生物強化技術的作用形式

2.3.1 直接投加優勢菌種

直接投加所篩選出來的高效菌種是目前最為常見的作用形式，生物反應池內含有龐大微生物群體，在它們的協同作用下可以對污水達到處理效果（Herrero et al.，2015），因此盡管純種菌對特定的污染物質有很好的降解效果，但是實際中混合菌種對于污染物質降解的應用更加廣泛和有效。Yao et al.（2013）提出生物增強技術成功的關鍵因素在于新引入的高效菌株是否可以在原生物處理系統中存活并融入。而采用混合菌種投加方法是使生物強化技術成功的有效策略，即使在這些混合微生物中并不是所有的都可以起到降解目標污染物的效能。對四氫呋喃的生物強化降解實驗中，在只接種降解菌Rhodococcussp. YYL的反應器中，發現在接種初期，該菌株起到了一定的降解作用，但是經過一段時間后，該菌株并未成功在反應器中存活，而在接種混合菌株的反應器中，Rhodococcussp. YYL能迅速定植并成為優勢菌株，對四氫呋喃起到降解效果。Kumar et al.（2018）通過分析指出混合菌種在對紡織染料的降解過程中表現出比純種菌更好的效果，主要是由于混合菌種之間的協同作用更有利于紡織染料的降解。在污水生物降解過程中使用單一微生物可能達不到降解效果，使用混合菌種可能提高生物降解過程中的微生物量、生長效率及其產酶量，而且由于一種微生物的產物可能成為另一種微生物的底物，所以混合培養可以克服微生物之間的反饋調節機制和代謝抑制情況（Dhall et al.，2012）。Mazzucotelli et al.（2014）采用混合優勢菌種對乳品廢水進行生物強化處理，經過實驗發現其對脂肪和蛋白質的降解效率可以達到80%以上，顯著改善了乳品廢水的降解效果。

2.3.2 微生物固定化技術

微生物固定化技術主要是采用物理或化學的方法將游離的菌種固定在限定的空間區域內，使微生物保持活性的一種方法（劉紫君，2018）。固定化技術可以使微生物在反應器中不易流失，從而達到降解效果（Li et al.，2013）。同時，可以減小與土著微生物之間的競爭；控制營養物質的流失；有效降低有毒化合物的濃度；防止高效菌株被系統中的原生動物所捕食等（Sanjeevkumar et al.，2013）。Wang et al.（2015）采用固定化技術進行高效菌株降解喹啉實驗，去除效果比接種游離高效菌株的反應器更好。處理技術組合也是常使用手段來進一步提升處理效能，Zhou et al.（2015）研究了用氧化石墨烯改性聚乙烯醇固定化微生物從而提高了鹽堿微生物的數量和活性，對目標污染物具有更好的降解效率。相較于各種不同材料的固定化載體，細菌生物膜作為天然載體的自固定化技術由于其自身所具有的成本低廉、簡單可行等優點而在水處理中有著潛在的應用前景（Cheng et al.，2015a）。Cheng et al.（2015b）利用多種微生物具有自絮凝產生共聚體的特性，可以使其形成生物膜載體，從而達到對3, 5-二硝基苯甲酸很好的降解效果。

2.3.3 生物強化菌劑

從自然界中篩選出來具有特定降解功能的微生物菌群，經發酵擴大培養而制成的菌液制劑或干粉制劑被稱為生物強化菌劑（徐軍祥，2007）。代鵬飛等（2015）將生物強化菌劑投加到 SBR中，COD去除和抗沖擊負荷能力均遠遠高于對照組。王越興等（2016）研究了微生物菌劑對污泥中微生物群落的影響，結果顯示在投加生物菌劑后，系統中的物種組成更復雜，物種豐度更高，有利于脫氫酶的分泌，繼而使得有機質能更好的分解，最終有利于污泥減量。

3 生物強化技術的應用

生物強化技術的應用領域愈發廣泛，劉書宇等（2008）通過向景觀水體投加功能微生物菌群來提高復合生態床對景觀水體污染物的去除率。Cycoń et al.（2017）闡述了生物強化技術在土壤修復應用，通過引入特定的微生物對受不同類農藥污染土壤都具有很好的修復效果。生物強化產能方面也逐漸受到關注，Lin et al.（2018）經過實驗發現在接種重組的銅綠假單胞菌株的強化反應器中，N2O的產量會有顯著的提升。Wang et al.（2018b）通過實驗應用生物強化技術既降解了苯酚，又提高了 H2的產量。Lebiocka et al.（2018）對污泥的處理采用生物強化技術，能有效地改善污泥厭氧消化性能，從而提高產甲烷效率。表3和表4總結了近幾年來生物強化技術分別在工業廢水和城市污水處理方面的應用。

4 生物強化技術研究存在問題和新路徑

如前所述，污水含有眾多復雜且難降解污染物，致使僅采用土著微生物難以滿足排放標準，但是，生物強化技術盡管很早開展研究且部分在實際中有很好的應用效果，還是不能否認生物強化技術現階段仍然存在很多問題，例如，（1）生物反應系統內存在原生動物捕食優勢菌，導致優勢菌可能接種率降低，這點可以通過固定化微生物技術提高接種率；（2）外加強化菌群與土著微生物可能存在競爭/拮抗關系，可能會使優勢菌很難攝取足夠的營養以維持生長，這點可以通過直接采取原水或污泥作菌源進行富集馴化篩路徑解決；（3）投菌量不足再加上菌種在水體中的流失可能會使優勢菌種難以在系統中大量增殖，這點可以通過優化工藝操作參數路徑解決；（4）優勢菌株進入系統后，優先利用的是容易利用的底物，這樣會導致菌株對目標污染物的降解速率緩慢，這點可以通過實驗篩選快速高效選擇目標污染物性能的菌株路徑解決；（5）復合污染物存在，導致單一優勢菌可能達不到降解效果，這點可以基于群體感應的篩選多種不同功能菌株組合成一個混合菌群組合路徑解決。

表3 生物強化技術在工業廢水處理中的應用Table 3 The application of bioaugmentation technology in industrial wastewater treatment

表4 生物強化技術在城市污水處理中的應用Table 4 The application of bioaugmentation technology in municipal wastewater treatment