一株油脂降解菌的篩選及其降解條件優化

王亞軍，蔡文娟，耿沖沖，王惠，張蓉，陳甜靖，李金守

1. 蘭州理工大學土木工程學院，甘肅 蘭州 730050；2. 蘭州興蓉環境發展有限責任公司，甘肅 蘭州 730070

近些年來，含油廢水的排放量不斷增加，這些含油廢水主要來自肉類加工行業、餐飲業、動植物油加工廠等。油脂會對水環境造成嚴重的危害，例如水體中的油脂會形成油膜漂浮在水面，使水體與外界環境間氧氣的傳輸過程受到阻礙，威脅水生動植物及微生物的生長；另外油膜的存在使水體中的廢氣和溫度難以逸散，致使水質黑臭；而油脂水解時產生的長鏈脂肪酸等一些中間產物對水環境中的某些生物具有一定的毒害性，甚至會破壞水系統的平衡狀態（秦華明，2003）。現階段，對于含油污廢水的處理方法主要有物理法和化學法，但這兩種方法在處理過程中仍存在一定的局限性；生物法的處理成本低廉，效果也較好，并且對環境無二次污染，因此得到普遍認可與廣泛推崇（Asses et al.，2009；Song et al.，2011）。生物處理法主要利用某些對于油脂具有降解功能的微生物自身所產生的脂肪酶（Hasan et al.，2009）將油脂水解為甘油和脂肪酸。有研究表明，油脂的水解過程是油脂廢水處理的限速步驟（劉國防，2012）。

現階段，國內外有關油脂降解菌的研究報道并不多，并且主要集中在水處理領域。為減少油脂對庫區河流的污染，史紅玲等（2019）經篩選獲得一株變形桿菌（Proteus mirabilis）NY-201801，最優的條件下對油脂的降解率可達92%，并且具有較好的環境適應性，對水生態安全的保護具有重要意義。對于高濃度含油廢水的處理，Gao et al.（2019）從含油污泥中篩選出3株油脂降解菌，它們對初始質量濃度在20 g·L?1的油脂降解率均在95%以上，并且當初始油的質量濃度增加到100 g·L?1時，其對油脂的降解率仍在40%左右，說明該研究所篩選出的菌株在高質量濃度油脂污廢水的處理中具備很好的應用潛力。對于高鹽度含油廢水的處理，Yan et al.（2018）篩選出2株對大豆油具有降解效果的菌株，經過5 d的培養，它們的降解率均在50%以上，對其進行耐鹽性的測試，最終結果顯示其中一株更適合降解餐廚廢水。另外油脂降解菌還可應用于畜禽尸體堆肥，肖翰等（2017）篩選出一株粘質沙雷氏菌（Serratia marcescem）D-4油脂降解菌，當該菌株培養96 h時降解率約為57%，相比于對照組油脂降解率更高。目前，研究報道出的油脂降解菌還有不動桿菌屬（Acinetobactersp.）、假單胞桿菌屬（Pseudomonassp.）（Sugimori et al.，2012）、氣單胞菌屬（Aeromonassp.）（Affandi et al.，2014）等。

油脂自身具有難降解特性，若僅靠土著微生物降解，最終效果遠遠達不到標準，而且油脂也是污水中CODCr的組分（劉婕等，2010），若不進行處理會影響出水水質。經調研發現，近些年來蘭州市生活污水中的含油量與日俱增，這給污水處理廠的運行帶來一系列問題，一方面污水廠現有的設備條件難以對油脂進行有效處理，另一方面油脂的存在影響到生化池處理效果，最終導致污水廠出水水質難以達標。目前所報道出的油脂降解菌基本篩選自高濃度含油廢水或食堂下水道，這些菌株對油脂的降解效果好，但是由于外來菌株與土著微生物有競爭關系，使得篩選出的油脂降解菌在生活污水中難以存活，另外生活污水成分有別于高濃度含油廢水，其油脂濃度遠遠偏低，因此生活污水中的營養物質滿足不了這些從高濃度含油廢水或食堂下水道中所篩選出的油脂降解菌的要求，以至于油脂降解菌難以發揮其真正有效的作用。基于上述各個問題，本研究從蘭州市某生活污水處理廠的剩余污泥中篩選分離出對油脂具有降解功能的微生物，為生物處理含油污水提供更合適的菌種選擇，并期望可以通過原位投加的方式解決污水處理廠對油脂處理效果不佳的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離源

本實驗所用的菌種分離源是蘭州市某生活污水處理廠的剩余污泥，將采集的樣品裝入經紫外線殺菌后的封口袋中，放入?20 ℃的冰箱中保藏備用。

1.1.2 培養基

LB培養基：蛋白胨10.0 g·L?1，酵母膏5.0 g·L?1，NaCl 5.0 g·L?1，pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min。

富集培養基：LB培養基加金龍魚菜籽油 3.0 g·L?1。

選擇培養基：KH2PO40.3 g·L?1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L?1，K2HPO41.5 g·L?1，(NH4)2SO41.0 g·L?1，NaCl 5.0 g·L?1，金龍魚菜籽油 3.0 g·L?1，瓊脂 18 g·L?1，pH 7.0，121 ℃ 滅菌 20 min。

復篩培養基：成分同選擇培養基，不含瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 高效油脂降解菌的篩選

稱5 g樣本污泥到三角瓶中并用45 mL無菌水稀釋成泥水混合液，放在恒溫磁力攪拌器上攪拌約10 min，使菌膠團充分被打散，靜置數分鐘后，吸取 1 mL上清液接種于 50 mL富集培養基中，在30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中培養，每7天為一個周期。吸取1 mL培養液轉接到新的富集培養基中，期間觀察油脂降解情況，若發現培養基中油脂降解較好時，就補加少量菜籽油。對上述過程循環進行4個周期。吸取馴化后的菌液進行梯度稀釋并涂布于選擇培養基中，在 30 ℃的生化培養箱中進行48 h的培養，期間對菌種的生長狀況進行觀察，挑取培養基中透明圈直徑約為菌落直徑2倍的菌株（閆紅梅等，2013），然后進行劃線分離得到純種菌。用接種環挑取菌株，接到50 mL復篩培養基中，在 30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中培養72 h，同時設未接菌培養基為對照，測定培養液中的含油量，篩選出油脂降解率高的菌株。

1.2.2 種子液的制備

挑取一環菌苔（30 ℃下培養了 24 h）接種到LB培養基中，在30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，通過調節和鏡檢使菌懸液濃度約為 1×108CFU·mL?1。

1.3 油脂降解菌的鑒定

根據《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠等，2001）對菌株的形態和生理生化特征進行鑒定。菌株的16S rDNA測序鑒定和系統發育樹構建均由廣州美格生物科技有限公司完成。

1.4 油脂降解菌降解特性初步研究

1.4.1 生長曲線的測定

接種6%（V/V）的種子液于150 mL液體LB培養基中，在 30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中培養72 h，每4小時取樣一次用紫外分光光度計測定OD600的值，即為菌體細胞密度，根據所測定的吸光度值繪制菌株的生長曲線。

1.4.2 不同時間對油脂的降解情況

為考察該菌株在不同時間段內對菜籽油的降解效果，接種6%（V/V）的種子液于150 mL復篩培養基中，在 30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中進行培養，每 12小時取樣一次，分別測定各時間點的油脂降解率（Oil degradation rate，d(O)/%）和OD600。

1.4.3 共基質對菌株降解性能的影響

向50 mL復篩培養基中加入不同基質（淀粉、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏），接入6%（V/V）種子液，在 30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中培養 72 h后測定油脂降解率（張慶云等，2017）。

以上每組設置3個平行實驗。

1.5 油脂降解菌降解條件優化

1.5.1 接種量

分別移取2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%（V/V）的種子液，按不同接種量（Inoculation volume，v/%）轉接到含50 mL復篩培養液的250 mL錐形瓶中，在 30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中經過72 h培養后，測定不同接種量下菌株對菜籽油的降解率和OD600。

1.5.2 初始pH

接種6%（V/V）的種子液于50 mL pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的復篩培養基中，在30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中進行 72 h 培養，測定不同pH下菌株對菜籽油的降解率和OD600。

1.5.3 培養溫度

將6%（V/V）的種子液轉接到含50 mL復篩培養液的250 mL錐形瓶中，按不同溫度（Temperature，?/℃）分別將培養基置于 15、20、25、30、35、40 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中進行72 h培養，測定不同溫度下菌株對菜籽油的降解率和OD600。

1.5.4 初始NaCl的質量濃度

將6%（V/V）的種子液轉接到含50 mL復篩培養液的 250 mL錐形瓶中，該培養基中初始 NaCl質量濃度（NaCl concentration，ρ(NaCl)/(g·L?1)）分別為 0、2.5、5.0、7.5、10.0、15 g·L?1，在 30 ℃，150 r·min?1的恒溫振蕩培養箱中進行72 h培養，分別測定不同 NaCl質量濃度下菌株對菜籽油的降解率和OD600。

以上每組設置3個平行實驗。

1.6 油脂降解菌對實際污水的降解

實驗按最優降解率下所對應的條件進行設定，向已滅菌的裝有150 mL實際生活污水的三角瓶中接入種子液，置于恒溫振蕩培養箱中進行72 h的培養，測定培養基中油脂和 CODCr的含量。設置 3組平行實驗。

1.7 檢測項目與方法

菜籽油回歸方程：精確稱取1.00 g菜籽油溶解于石油醚中，配制成10 g·L?1的菜籽油標準液。吸取梯度體積的菜籽油標準液并用石油醚稀釋，配制質量濃度梯度為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 g·L?1的菜籽油溶液。以石油醚為空白，測定各質量濃度下菜籽油溶液的OD230值，依此繪制標準曲線并得到回歸方程為：y=0.512x+0.0026，相關系數為0.9996。

菜籽油質量濃度：參考秦華明（2003）和沈叔平等（1994）采用紫外分光光度法對油脂進行測定。

CODCr：采用重鉻酸鉀法進行測定。

1.8 數據處理

研究數據采用Excel進行數據統計分析，應用Origin 9.0進行制圖。

2 結果與分析

2.1 油脂降解菌的篩選

選取選擇培養基中形態顯著的菌株，經劃線分離得到了3株具有較大透明圈的菌株。經過篩選最終得到一株對油脂降解效果最好的菌株YZ-1，該菌株在72 h內對菜籽油的降解率為54.91%。

2.2 油脂降解菌的鑒定

菌株 YZ-1為革蘭氏陰性菌，其菌落在固體培養基上呈圓形半透明狀。菌株 YZ-1的生理生化特征如表1所示。經鑒定菌株YZ-1與銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）的相似度在99.9%以上（表2），基于16S rDNA序列分析與比對對菌株YZ-1進一步進行表征，利用 MEGA軟件構建系統發育樹如圖1所示。

表1 菌株YZ-1的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain YZ-1

表2 通過16S rDNA基因序列分析鑒定菌株YZ-1Table 2 Identification of strain YZ-1 by 16S rDNA gene sequence analysis

2.3 油脂降解菌降解特性初步研究

2.3.1 生長曲線的測定

圖1 菌株 YZ-1 系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of strain YZ-1

圖2 菌株YZ-1降解特性初步研究Fig. 2 Preliminary study on the degradation characteristics of strain YZ-1

微生物的生長曲線可以直觀地反映其生長規律和增殖情況。從圖2a可以看出，在接種量為6%（V/V）的情況下，油脂降解菌YZ-1在0—32 h時很快適應新的環境，菌體數量快速增加。32—60 h時菌株YZ-1處于穩定生長時期，生長逐漸趨于平緩，說明代謝產物的積累和營養物質比例失衡影響了微生物的生長，菌體數量達到峰值，OD600值為2.409。60 h后，曲線呈現了逐漸下降的趨勢，說明菌株從此時開始便進入到衰亡期。

2.3.2 不同時間對油脂的降解情況

為進一步考察菌株YZ-1對油脂的降解情況，本研究每 12小時對培養基中油脂含量進行測定并計算其降解率，如圖2b所示，經過72 h菌株YZ-1對油脂的降解率為55.37%。在0—24 h時，由于培養基中的環境適宜、營養物質充足，菌株利用培養基中的油脂進行自身的生長與繁殖，因此油脂降解率大幅度增加。24—60 h時，菌體數量繼續增大，對油脂的降解率也逐步提高。經過60 h的培養，菌株對油脂的代謝能力逐漸減弱，其主要原因有環境變化、營養物質比例失衡、代謝產物長鏈脂肪酸的積累。油脂水解過程中由于脂肪酸的產生，會使培養基中的pH發生明顯變化（Affandi et al.，2014；高貴等，2005），營養物質也相繼消耗，同時油脂水解后的中間產物長鏈脂肪酸對菌株也有毒害作用（段艷平等，2008），從而會威脅菌株的生存和增殖。

2.3.3 共基質對菌株降解性能的影響

實際污水中有機物的成分較為復雜，一般情況下微生物會優先利用容易降解的有機物而影響對目標污染物的去除效果，因此研究共基質的存在對油脂降解率的影響是很有必要的。從圖 2c可以看出，不同共基質對油脂的降解效果影響不同，在加入淀粉的培養基中油脂的降解效果要優于對照組，菌體數量也有所增長，說明淀粉在一定程度上促進了菌株YZ-1的生長，從而提高了油脂降解效率（郭靜波等，2018）。而其它組的油脂降解率均低于對照組，可能的原因是共基質被菌株YZ-1優先利用，使其在一定時間內無法對油脂進行充分的降解（秦華明等，2007）。但總體而言，在共基質存在的情況下，菌株YZ-1對油脂仍保有降解效果。

2.4 油脂降解菌降解條件的優化

2.4.1 接種量

接種量的多少會影響微生物生長代謝能力，接種量少時，會降低反應體系中微生物的數量，導致培養時間延長，接種量大時，會增加反應體系的負荷（吳曉娜等，2018）。王佳君等（2017）研究了接種量對產甲烷菌產氣量的影響，結果表明由于接種量過大使得反應中產生大量的VFAs氣體，對產甲烷菌產生了抑制。另外，當接種量過大時，菌種會大量繁殖而聚集成球，導致體系中溶解氧的含量下降（康燕莉，2013）。因此選擇合適的接種量有利于菌株對于油脂的降解。

圖3a是不同接種量下菌株YZ-1在對油脂的降解率。當培養基中的接種量為 12%（V/V）時，菌株YZ-1對菜籽油的降解率為59.42%，達到最大值，此時培養基中的OD600值亦達到最大，接種量大于或小于 12%（V/V）時，降解率均在減小。接種量會影響微生物生長調整期的長短，從圖中可以看出，當接種量為2%時，油脂的降解率為38.64%，OD600為 1.944，說明由于接種量太少，菌株 YZ-1需要更長的時間去適應環境并生長增殖，從而在72 h時內對菜籽油的降解效果未達到最優值。隨著接種量的增加，油脂降解率也隨之增加，說明隨著OD600的增長，菌株YZ-1能更加快速地分解油脂。當接種量為 14%（V/V）時，油脂降解率下降，可能的原因有菌株的快速繁殖與代謝，使得產生的代謝產物過多累積，并且影響到培養基中的氧氣含量，從而抑制了菌株進一步利用油脂的能力。

2.4.2 初始pH

pH是影響微生物生存很關鍵的因素，微生物在最適pH條件下的酶活力最高，生長率最快。由于微生物細胞內的 DNA、ATP等物質對酸較為敏感，而RNA、磷脂等對堿較為敏感，因此微生物細胞中的環境一般維持中性狀態（陳燕飛，2009）。外界環境的pH通過影響細胞膜的表面電荷來影響膜的通透性和酶的活性，進而影響微生物對營養物質的吸收過程，最終會使微生物的生長遭到抑制，甚至死亡。

圖3 接種量、初始pH、溫度初始NaCl質量濃度對菌株YZ-1油脂降解率的影響Fig. 3 Effect of inoculation volume, initial pH, temperature, initial NaCl concentration on oil degradation rate of strain YZ-1

圖3b是不同pH條件下菌株YZ-1對油脂降解率的變化情況，菌株YZ-1最適pH為8，油脂的降解率為61.28%，大于pH為7時的降解率，可能的原因是油脂水解后產生脂肪酸，會使培養基偏酸性，不利于菌株的生長。有研究報道稱銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）所分泌的脂肪酶具有一定的耐堿性（李文君等，2012），秦華明等（2003）分離出的銅綠假單胞油脂降解菌可以在pH為4—9的環境中生長，當pH為9時，對油脂降解率約為20%。菌株YZ-1可以在較廣的pH范圍內生存，對外界環境的變化具有一定的緩沖能力，而且菌株YZ-1在pH為5—9時，降解率均在40%以上。

2.4.3 培養溫度

溫度在微生物生長環境因子中起很重要的作用，對于大多數微生物而言，溫度過高會使得細胞發生不可逆的損傷，而溫度過低會抑制酶的活性，影響微生物的代謝功能，更甚者會使原生質體內的水分結冰，從而導致細胞死亡。因此選擇微生物生長最適溫度有利于微生物的增殖和對營養物質的代謝。

菌株 YZ-1在 15—40 ℃的范圍內對油脂均有一定的降解效果，如圖 3c所示。其最高的降解率是處于 30 ℃時，當溫度低于 30 ℃，油脂降解率和OD600均呈現較低的趨勢，說明低溫環境抑制了菌株YZ-1的增殖和分泌脂肪酶的能力，或脂肪酶在低溫環境中的比活力有所降低，最終影響對油脂的降解效果。當溫度大于30 ℃時，菌株YZ-1對油脂的降解率也逐漸減小，原因是溫度促進了生化反應的進行，使菌株增殖加快，營養物質快速消耗，代謝產物過量積累，導致其代謝能力變弱，但是對于油脂的降解率仍然維持在50%以上。由此可以得出，菌株 YZ-1適宜生長的溫度范圍較廣，對外界環境的變化具有一定的抵抗能力。

2.4.4 初始NaCl質量濃度

微生物細胞的滲透壓可以通過Na+、K+等簡單的金屬離子和化合物來維持。高質量濃度 NaCl會抑制微生物的酶活性，導致其呼吸速率、生長繁殖速率和對營養物質的吸收能力降低，另外高鹽環境會使細胞處于高滲狀態，細胞容易脫水甚至死亡（Kai et al.，2012；Pendashteh et al.，2010）。而當NaCl質量濃度過低，細胞處于低滲環境時引起細胞膨脹，亦會影響微生物的吸收能力。生存環境為等滲狀態時，微生物的生長情況較好。

不同質量濃度的NaCl對菌株YZ-1降解菜籽油的影響結果如圖3d所示，當NaCl質量濃度處在0—15 g·L?1時，菌株YZ-1對油脂均有降解效果。油脂降解率最高時所對應的 NaCl質量濃度為 2.5 g·L?1，隨著環境中NaCl質量濃度不斷增大，菌株YZ-1細胞中的水不斷向細胞外滲透，影響菌株生長，導致油脂降解率逐漸減弱，但當NaCl質量濃度達到 10 g·L?1和 15 g·L?1時，菌株 YZ-1 在 72 h內對油脂的降解率分別為 44%、35%，遠遠高于Yan et al.（2018）4-5所篩選出的2株耐鹽油脂降解菌在同等NaCl質量濃度下經5 d時間對油脂的降解率。為驗證在低滲情況下菌株YZ-1的生長狀況，本研究對NaCl質量濃度為0時的情況做了實驗，實驗結果顯示在不加NaCl時菌株YZ-1的生長情況良好，主要原因是由于培養基中含有大量的K+，它不但是細胞內某些酶的激活劑，而且也可以簡單維持細胞的滲透壓，雖然菌株YZ-1處于低滲狀態，但是對其生長增殖的影響并不是很大。

2.5 油脂降解菌對實際污水的降解

經過油脂降解條件的單因素優化實驗，得到了在72 h內當接種量為12%（V/V）、pH為8、溫度為 30 ℃、初始 NaCl質量濃度為 2.5 g·L?1時分別對應了各條件下的最高油脂降解率。進一步通過實驗研究菌株YZ-1在最優條件下對實際污水中的油脂和CODCr的降解效果，結果如表3所示。菌株YZ-1對于實際污水中CODCr的降解作用如圖4所示。

表3 菌株YZ-1對實際污水的降解Table 3 Degradation of actual sewage by strain YZ-1

3 結論

從蘭州市某生活污水廠取得剩余污泥樣品，將其進行富集馴化、分離篩選獲得一株油脂降解菌，并對該菌進行了鑒定和單因素降解條件的優化，結論如下所述：

（1）篩選得到一株菌株 YZ-1在以菜籽油為唯一碳源的培養基中生長良好。經過鑒定菌株 YZ-1與銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）的相似度在99.9%以上，因此該菌株為銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）。

（2）對降解特性進行初步研究發現菌株 YZ-1在72 h內對油脂的降解率可達到55%，說明該菌株可以分泌脂肪酶，具備降解油脂的功能。不同共基質對油脂的降解效果影響不同，淀粉作為共基質一定程度上促進了菌株YZ-1的生長，從而提高了油脂降解率。

圖4 菌株YZ-1對實際污水中CODCr的降解率Fig. 4 Degradation rate of CODCr in actual sewage by strain YZ-1

（3）對菌株 YZ-1進行單因素降解條件的優化實驗，最終發現當接種量為12%（V/V）、pH為8、溫度在 30 ℃、NaCl質量濃度為 2.5 g·L?1時，菌株YZ-1在72 h內對油脂的降解率達到最大值，分別為 59.42%、61.28%、55.33%、64.14%，對應的菌體細胞密度均大于 2.5。且當接種量在 6%—14%（V/V），pH在7—9，溫度在30—40 ℃，NaCl質量濃度在0—5 g·L?1范圍內，菌株YZ-1生長良好，降解率波動不大。

（4）研究菌株 YZ-1對實際污水的降解效果，在接種量為12%（V/V）、pH為8、溫度為30 ℃、NaCl質量濃度為2.5 g·L?1下菌株YZ-1對實際污水中的油脂和 CODCr的降解率分別為 40.50%和45.83%。