萬壽菊多糖的純化、組成分析及其體外抗氧化和抗腫瘤活性研究

何念武，曹思娟，張咪

1(商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛， 726000)2(陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院(商洛學院)，陜西 商洛， 726000)

萬壽菊(TageteserectaL.)為菊科萬壽菊屬一年生草本植物萬壽菊的花，于每年夏秋季節(jié)采收，其花和葉干燥后均可入藥，具有清熱化痰、補血通經(jīng)、去淤生新之功效[1-3]。萬壽菊原產(chǎn)自墨西哥，因其生存能力和適應(yīng)性極強，在我國南北方常被用作觀賞植物進行栽培，資源極為豐富[4-5]。研究表明，萬壽菊主要含有噻吩類[6]、精油類[2]、葉黃素類[7-9]、黃酮類及其苷類[10]、生物堿類和萜類等成分[3,11-12]，尤其是噻吩類成分作為菊科植物的特征性次代謝生產(chǎn)物，具有廣泛的殺蟲活性[6]；葉黃素類成分在老年性黃斑退化病和白內(nèi)障疾病防治、緩解視疲勞等方面具有重要作用[13]，亦有抗氧化、抗腫瘤和預(yù)防心血管疾病等功效，在食品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[14-16]。當前，學界對萬壽菊的研究主要集中在葉黃素分離提取和藥理活性，而對萬壽菊多糖的研究鮮有報道?；诖?，本研究以萬壽菊為原料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提乙醇沉淀法提取萬壽菊多糖(TageteserectaL. polysaccharides，TEPs)工藝，繼而采用DEAE-52纖維素和Sephadex G-100柱層析法進行分離純化，在此基礎(chǔ)上探究萬壽菊多糖體外抗氧化和抑瘤規(guī)律，以期為萬壽菊的深加工和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬壽菊于2018年8～9月采集自陜西省洛南縣饅頭山地區(qū)，經(jīng)商洛學院制藥工程教研室鑒定為菊科萬壽菊屬植物萬壽菊的花，晾曬干后備用。

DEAE-52纖維素、Sephadex G-100、葡聚糖T系列、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦味基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate acid,ABTS)，美國Sigma-Aldrich公司；DMEM細胞培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；其他分析試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要設(shè)備

LC-10A高效液相色譜儀(含示差折光檢測器)，島津公司；Form311 CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；RT6000酶標分析儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司；TGL-16M超低溫高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；BSC-1000IIA2生物安全柜，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 TEPs分離制備方法

1.3.1 TEPs提取及工藝優(yōu)化

1.3.1.1 TEPs提取

稱取萬壽菊粉末50 g，置于提取容器中，加入20倍體積的蒸餾水，在80 ℃水浴下恒溫浸提2 h，過濾，將濾渣按照第1次提取方法重復(fù)提取2次[17]。將3次濾液合并，減壓濃縮至100～200 mL。向濃縮液中加4倍體積無水乙醇，于4 ℃靜置過夜后以4 000 r/min離心10 min，棄上清液(回收乙醇)，沉淀溶解于少量蒸餾水中，透析3 d(每4 h換一次透析溶液)，去除小分子雜質(zhì)，冷凍干燥后即得萬壽菊多糖粗提物，采用苯酚-硫酸法測定糖含量[17-18]，多糖提取率按公式(1)計算：

(1)

1.3.1.2 TEPs提取工藝優(yōu)化

單因素實驗方法：分別稱取萬壽菊粉末10 g置于5個圓底燒瓶中，按1∶20體積比加蒸餾水，于80 ℃恒溫水浴浸提3次，合并提取液，濃縮干燥，計算多糖提取率，以此考察提取時間為1、1.5、2、2.5和3 h對多糖提取率的影響；固定料液比為1∶20(g∶mL,下同)，提取時間為2 h，提取次數(shù)3次，考察提取溫度為60，70，80，90，100 ℃時對多糖提取率的影響；在80 ℃恒溫水浴分別浸提3次，每次浸提2 h，考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)對多糖提取率的影響；最后，固定提取溫度80 ℃、時間2 h、料液比為1∶20，考察提取次數(shù)對多糖提取率的影響[18]。

響應(yīng)面優(yōu)化實驗：以萬壽菊多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，基于單因素實驗結(jié)果，優(yōu)選主要影響因素，采用Box-Behnken進行響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化實驗[19-20]。

1.3.2 DEAE-52纖維素和Sephadex G-100柱色譜法分離純化TEPs

稱取100 mg TEPs，溶于適量去離子水中，進行上樣，而后打開DEAE-52纖維素層析柱(2.8 cm×60 cm)[17,21-23]下端的螺旋夾，使樣品進入交換劑中，待樣品快要進完時，加入少量緩沖液沖洗柱壁，待吸附12 h后分別用去離子水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，用自動部分收集器收集洗脫液，流速為1 mL/min，5 mL/管，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測[17]，以492 nm吸光值對洗脫管數(shù)作圖，根據(jù)洗脫曲線分段合并，減壓、濃縮、透析后分別上樣于Sephadex G-100層析柱(1.6 cm×90 cm)[17,21-23]，去離子水洗脫，流速0.35 mL/min，4 mL/管，苯酚-硫酸法跟蹤檢測[17]，繪制TEPs純化洗脫曲線。合并洗脫峰值處相應(yīng)洗脫液，真空冷凍干燥后即得TEPs不同組分樣品。

1.3.3 TEPs重均分子量測定及單糖組成分析

參照文獻[17,24]中高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)測定多糖重均分子量和高效液相色譜法分析其單糖組成。

1.4 TEPs體外抗氧化活性規(guī)律分析

TEPs對DPPH自由基、羥自由基(·OH)、ABTS自由基和超氧陰離子自由基(O2-·)清除實驗均參照本課題組已有方法進行[17,24-25]

1.5 TEPs體外抑瘤活性測定

以MTT法[25-27]檢測TEPs對MCF-7細胞的生長抑制作用。取對數(shù)生長期(5×104～1×105個/mL)細胞1 mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h待完全貼壁生長后棄上清液；每孔加新鮮培養(yǎng)液900 μL和100 μL質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200 μg/mL的待測TEPs溶液，以環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)作為陽性對照，陰性對照以生理鹽水補足，繼續(xù)培養(yǎng)44 h，加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL，4 h后用十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)三聯(lián)液終止反應(yīng)。采用酶標分析儀于570 nm處檢測OD值，每處理設(shè)置5個重復(fù)，按公式(3)計算抑制率：

抑制率/%=

(2)

以TEPs質(zhì)量濃度為橫坐標，其對MCF-7細胞的抑制率為縱坐標繪制曲線，計算半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration,IC50)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

單因素實驗、抗氧化和抑瘤實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析，響應(yīng)面實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.05b軟件進行，所有實驗至少平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 TEPs提取單因素實驗結(jié)果

從圖1-a可知，萬壽菊多糖提取率隨著提取時間的延長而呈現(xiàn)先增后減的規(guī)律，在提取2 h時達到峰值，此后隨著提取時間的延長提取率有所下降。因而，在本實驗條件下，萬壽菊多糖最佳提取時間為2 h。由圖1-b可知，隨著提取溫度不斷升高，TEPs提取率先快速增長而后緩慢下降，在80 ℃時達到極值。因此，選擇80 ℃作為TEPs最佳提取溫度。由圖1-c可知，TEPs提取率隨著提取溶劑倍數(shù)的不斷增加而呈上升趨勢，在提取溶劑(mL)用量為原材料(g)20倍以下(即料液比1∶20)的條件下，提取率增長幅度較快；提取溶劑用量大于20倍時，多糖提取率亦有所增加但增幅非常小，從經(jīng)濟高效的角度考慮選擇料液比為1∶20為最佳。從圖1-d可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，TEPs提取率先增后減，在提取3次的時候達到峰值。因此，從節(jié)省實驗時間和成本等方面綜合考慮選擇提取3次為最佳條件，并結(jié)合張雪春等[28]的處理方法，后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實驗時不再考察提取次數(shù)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化TEPs提取工藝結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計實驗結(jié)果

基于單因素實驗結(jié)果，從經(jīng)濟和節(jié)省時間的角度考量固定提取次數(shù)為3次，選取提取時間、提取溫度和料液比作為實驗因素，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，因素水平表及響應(yīng)面實驗結(jié)果如表1和表2所示。

a-提取時間；b-提取溫度；c-料液比；d-提取次數(shù)圖1 不同因素對萬壽菊多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different factors on the extraction yield of TEPs

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and level of Box-Behnken test

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

2.2.2 多元回歸方程的構(gòu)建與分析

采用Design-Expert 8.0.5b軟件對表2的實驗結(jié)果進行方差分析(表3)，進行多元回歸擬合可得TEPs多糖提取率與提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)的二次回歸方程為：Y=3.70+0.16A+0.1B+0.056C+0.08AB+0.038AC+0.039BC-0.16A2-0.2B2-0.25C2

如圖2所示，TEPs提取率隨著3個因素的變化而呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，等高線的形狀可以反映出2個因素交互作用的強弱，其中近橢圓形狀表示交互作用顯著，近圓形則表示不顯著[29]。由圖中可以看出提取溫度和提取時間、料液比交互作用顯著，提取時間和料液比交互作用不顯著，這與表3中顯著性檢驗結(jié)果一致。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

a-提取溫度與提取時間；b-提取溫度與料液比；c-提取時間與料液比圖2 提取溫度、提取時間、料液比對TEPs提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagrams of the effect of extraction temperature， time， solid-to-solvent ratio on TEPs extraction yield

2.2.3 TEPs提取工藝優(yōu)化與驗證

通過對上述回歸方程求偏導(dǎo)得最佳提取條件為：提取溫度80.47 ℃、提取時間2.02 h、料液比1∶20.95(g∶mL)，利用回歸方程計算的預(yù)測值是3.732%，而實驗過程中各因素0水平時,5次試驗平均得率為(3.700±0.038)%，該模型優(yōu)化工藝預(yù)測提取率提高了8.65%。綜合考慮實際可操作性，將上述條件修正為：提取溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶21(g∶mL)。在此條件下，進行3次驗證實驗，TEPs平均提取率為(3.707±0.072)%，低于模型預(yù)測值0.67%，符合客觀實際。

2.3 TEPs分離純化結(jié)果

TEPs經(jīng)過DEAE-52纖維素柱層析后，洗脫曲線如圖3所示。經(jīng)去離子水和0.1～0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，得到大小不等5個洗脫峰，其中峰1和峰5幾乎可忽略不計，峰3的多糖含量過低，沒有進一步研究價值，只有峰2和峰4含量最高，進一步將其濃縮、透析后經(jīng)Sephadex G-100柱層析純化，得圖4所示洗脫峰，由峰2和峰4各得到單一對稱洗脫峰，將洗脫液收集、濃縮、冷凍干燥備用，分別命名為TEPs-1和TEPs-2，經(jīng)測定二者總糖含量分別為79.27%和87.71%。

圖3 TEPs的DEAE-52洗脫曲線Fig.3 The elution curve of TEPs on DEAE-52

a-TEPs-1; b-TEPs-2圖4 TEPs的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.4 The elution curve of TEPs on Sephadex G-100

2.4 TEPs各組分重均分子量和單糖組成分析

2.4.1 TEPs-1和TEPs-2重均分子量

經(jīng)HPSEC對TEPs 2個組分進行分析，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，TEPs-1和TEPs-2的色譜峰均為單一對稱峰，表明該組分為均一多糖。根據(jù)葡聚糖系列得回歸方程為lgMw=7.512 8-0.497 3Rt，R2=0.987 7。根據(jù)保留時間計算得TEPs-1和TEPs-2重均分子量分別為4.69和5.73 kDa。

a-TEPs-1; b-TEPs-2圖5 TEPs-1和TEPs-2的HPSEC色譜圖Fig.5 HPSEC chromatograms of TEPs-1 and TEPs-2

2.4.2 TEPs-1和TEPs-2單糖組成分析

TEPs酸水解衍生物中單糖組成分析如圖6和表4所示。由圖6可以看出，TEPs-1和TEPs-2均由7種單糖組成，各組分單糖含量不盡相同且不含糖醛酸，說明TEPs是中性雜多糖[17,24]。而從表4中可以看出，TEPs 2個組分中甘露糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖4種單糖含量較高，而鼠李糖、木糖和巖藻糖的含量非常少。

1-甘露糖；2-核糖；3-鼠李糖；4-葡萄糖醛酸；5-半乳糖醛酸；6-葡萄糖；7-木糖；8-半乳糖；9-阿拉伯糖；10-巖藻糖;a-10種標準單糖；b-TEPs-1；c-TEPs-2圖6 TEPs-1、TEPs-2和混合標準單糖的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of mixture of monosaccharide standards

表4 TEPs酸水解衍生物中單糖組成 單位：%

2.5 TEPs體外抗氧化活性分析

2.5.1 對DPPH自由基的清除作用

TEPs經(jīng)純化后得到均一多糖TEPs-1和TEPs-2具有良好的抗氧化活性。由圖7-a可以看出，在TEPs質(zhì)量濃度為1.0～3.5 mg/mL范圍內(nèi)，2種多糖對DPPH自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)近似的線性遞增關(guān)系，TEPs-2增加幅度明顯高于TEPs-1，但都低于VC。

當質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時，TEPs-1、TEPs-2和VC對DPPH自由基的清除率分別為45.01%、88.33%和100%。此外，從表5中可以看出TEPs-1和TEPs-2對DPPH的IC50值分別為4.27和2.24 mg/mL。

2.5.2 對·OH的清除作用

由圖7-b可以看出，TEPs質(zhì)量濃度從1.0 mg/mL增加至3.5 mg/mL時，TEPs兩種組分對·OH的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。當質(zhì)量濃度大于2.5 mg/mL時，TEPs-2對·OH的清除率增幅較快，VC對自由基的清除率幾乎為100%，而TEPs-1則弱于TEPs-2。另外，從表5中可以看出TEPs-1和TEPs-2對·OH的IC50值分別為5.28和2.48 mg/mL。

2.5.3 對O2-·的清除作用

由圖7-c可知，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，濃度越大，對自由基清除能力越強，待測樣品和VC清除O2-·的能力大小順序依次為VC>TEPs-2>TEPs-1，TEPs-1和TEPs-2清除O2-·的IC50分別為4.38和2.62 mg/mL(表5)。

2.5.4 對ABTS自由基的清除作用

從圖7-d和表5中可以看出，在1.0～3.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品具有明顯的清除ABTS自由基的能力，TEPs 2種組分中TEPs-2清除能力更強，IC50為2.21 mg/mL，TEPs-1清除能力較弱，其IC50為3.94 mg/mL。由圖7-d可知，2種組分對ABTS自由基的清除能力均小于同濃度的VC，當濃度達到3.5 mg/mL時，TEPs-2清除能力接近于VC。有研究表明，多糖的抗氧化活性可能與其分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)有關(guān)[30]，TEPs經(jīng)分離純化得到了2種均一多糖，都有一定的抗氧化能力，但均未對其精細化結(jié)構(gòu)進行研究，故而更深層次的抗氧化機制有待于下一步深入研究。

a-DPPH自由基；b-·OH；c-O2-·；d-ABTS自由基圖7 TEPs-1和TEPs-2體外抗氧化活性Fig.7 In vitro antioxidant activities of TEPs-1 and TEPs-2

表5 TEPs對不同自由基體系清除能力的IC50值Table 5 IC50 values of TEPs for scavenging capacityof different free radical systems

2.6 TEPs體外抑制腫瘤細胞生長情況分析

TEPs不同組分和CTX對MCF-7細胞的生長抑制作用如圖8所示，TEPs兩個組分對MCF-7細胞均有不同程度的生長抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。當TEPs質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，TEPs-1對MCF-7的生長抑制率為40.82%，TEPs-2為73.45%，CTX為88.98%，說明TEPs-2對MCF-7細胞抑制率高于TEPs-1。經(jīng)Excel軟件計算可得，TEPs-1、TEPs-2和CTX的IC50值為319.76、134.04和67.77 μg/mL，三者之間存在顯著差異(P<0.05)。

圖8 TEPs對MCF-7細胞的抑制率Fig.8 Inhibition rate of TEPs on MCF-7 cells

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化萬壽菊多糖水提醇沉工藝為：提取溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶21(g∶mL)，在此條件下多糖提取率為3.7%。繼而采用DEAE-52和Sephadex G-100對TEPs進行純化得到TEPs-1和TEPs-2兩個均一組分，其總糖含量(質(zhì)量分數(shù))分別為79.27%和87.71%，重均分子質(zhì)量分別為4.69 kDa和5.73 kDa。TEPs兩種組分中甘露糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖4種單糖含量較高，且均由7種單糖組成。

在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，TEPs清除DPPH自由基、·OH、O2-·和ABTS自由基均呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系，質(zhì)量濃度越大清除率越高。TEPs-1清除DPPH自由基、·OH、O2-·和ABTS自由基的IC50依次為4.26、5.28、4.38、3.94 mg/mL；TEPs-2的IC50依次為2.24、2.48、2.62、2.21 mg/mL。

TEPs 兩個組分對MCF-7細胞均有一定生長抑制作用，且呈明顯的濃度依賴關(guān)系。當TEPs濃度為200 μg/mL時，TEPs-1和TEPs-2的生長抑制率分別為40.82%和73.45%。此外，TEPs-1和TEPs-2對MCF-7細胞的IC50分別為319.76和134.04 μg/mL。