果糖處理對冷藏雷竹筍品質和木質化的影響及其調控機制研究

周大祥，汪開拓,2*，匡文玲,3，雷長毅,2，邱玲嵐，黎春紅，蔣永波

1(重慶三峽學院 生物與食品工程學院，重慶，404000) 2(重慶三峽學院 環境與化學工程學院，重慶，404000)3(重慶市萬州區食品藥品檢驗所，重慶，404000)

雷竹(Phyllostachyspraecoxf. Preveynalis)為禾本科竹亞科剛竹屬竹種，是中國特有優質食用竹種，廣泛種植于我國江南、華南及西南各省，雷竹幼體(鞭梢和嫩芽)即為雷竹筍[1]。雷竹筍具有滋味鮮美、硬脆爽口、富含各種維生素及礦物質等優良食用和營養特性，深受市場歡迎。雷竹筍筍體嬌嫩，可食用率高，但采割時形成的筍體根部大面積機械傷可導致明顯的筍體失重(失水)現象，加快筍體呼吸強度和生理衰老速度，并刺激創面及筍體中心處木質素及纖維素的大量積累，從而使筍體出現質地生硬、粗糙少汁和表面褐變等典型木質化敗壞癥狀，嚴重降低了雷竹筍食用品質和商品性[2]。低溫冷藏(0～5 ℃)雖可有效控制雷竹筍采后失重現象，下調雷竹筍呼吸強度和生理代謝水平，但低溫環境也可誘導筍體中木質素合成相關酶活性的上升，促進筍體細胞壁中木質素積累，不利于延長冷藏周期[3]。現階段研究發現，采用涂膜、氣調包裝、低壓、熱激以及外源化學物質處理(如赤霉素、草酸和臭氧等)等方法均可延緩筍體低溫木質化癥狀的發展；但這些處理步驟較繁瑣，且筍體木質素單體類物質合成的抑制機制不清晰[4]。

苯丙烷類代謝途徑是植物酚酸、花青素、類黃酮、植保素和木質素等多酚類次生代謝產物合成的主要途徑，該途徑中的主要酶系活性或基因表達豐度在植物體遭受機械傷、病原菌侵染或環境脅迫時顯著上調，啟動相關逆境響應反應[5]。某些激發子(如茉莉酸甲酯、油菜素內酯或β-氨基丁酸)也可顯著誘導采后楊梅[6]、草莓[7]和葡萄[8]等果實植保素、酚酸、類黃酮或花色苷的合成，增強果實貯藏期間抗病性或抗氧化活性。但也有研究發現，楊梅果實[9]和葡萄細胞[10]在花色苷類物質或植保素(白藜蘆醇及其脫氫二聚體)大量合成的同時，也伴隨著蔗糖及尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)含量的顯著下降，其中UDPG正是苯丙烷類代謝途徑中合成酚類物質C6-C3-C6骨架的主要底物，可見，蔗糖與苯丙烷類代謝存在對UDPG的競爭性作用。此外，木質素是由香豆醇、松柏醇和芥子醇等單體構成的多聚體，其3種單體在通過苯丙烷類代謝途徑合成的過程中也需要大量UDPG來組成碳骨架[11]。因此，木質素合成與蔗糖代謝也可能存在密切聯系。本研究擬通過果糖處理來特征性分析采后雷竹筍冷藏期間苯丙烷類與蔗糖代謝的關聯性，以期從物質代謝的角度分析雷竹筍木質素合成機理，為延緩雷竹筍采后木質化敗壞進程提供可行性方案。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雷竹筍于2018年3月中旬和2019年3月上旬采收自重慶市江津區石蟆鎮楊柳村雷竹筍種植園，采收后6 h內運回實驗室。先剔除切割面不整齊、筍殼脫落或尚有霉菌斑點的雷竹筍，再選擇長度和直徑均一、外觀灰褐色的成熟筍體，平鋪并通風散去殘余田間熱。挑選出的雷竹筍切去老蔸，仔細去殼后備用。

濃H2SO4、丙酮、鄰菲羅啉、果糖(分析純)，重慶西南化學試劑公司；葡萄糖、果糖、蔗糖和UDPG標樣，美國Sigma公司；RNAprep Pure Kit，北京天根公司；chamQ universal SYBR qPCR master mix、HiScript III RT SuperMix for qPCR，南京Vazyme公司；甲醇、甲酸和乙腈均為色譜純，中國國藥集團有限公司。

PAL-1型手持數顯折光儀，日本Atago公司；GL-20G-II型冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；DW-86L型超低溫冰箱，海爾公司；TA-XT2i型質構儀，英國Stable Micro System公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；ABI QuantStudio7型實時熒光定量PCR儀，美國Thermo Fisher公司。

1.2 果糖處理

參考XU等[12]的方法進行果糖處理。第一批試驗主要分析不同濃度果糖處理對雷竹筍品質的影響，以尋找最適處理濃度。將去殼雷竹筍隨機分為5組，懸空平鋪于鏤空鐵絲網上，隨后分別用0(對照)、10、20、30或40 mmol/L的果糖溶液進行噴淋處理5 min(20 ℃)，期間緩慢翻轉筍體以保證噴淋均勻，隨后將雷竹筍置于封閉的無菌工作臺上充分晾干(避免病原菌和蟲蠅污染)。處理結束后，將雷竹筍分裝于60 μm厚的聚乙烯袋中，每袋5根筍體，袋口用橡皮筋纏繞2圈，于4 ℃、相對濕度80%～90%條件下貯藏20 d，每5 d取鮮樣測定木質化及品質參數。各處理組8袋雷竹筍，重復3次，整個實驗重復2次。

第二批試驗主要分析果糖處理減輕雷竹筍冷藏期間木質化敗壞的機理。將去殼雷竹筍隨機分為5組，分別用0(對照)、10、20、30或40 mmol/L的果糖溶液進行處理，方法同上。雷竹筍在4 ℃、相對濕度80%～90%條件下貯藏20 d，每5 d取鮮樣經液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，測定可溶性糖含量以及相關基因表達水平。各處理組10袋果實，重復3次，整個實驗重復2次。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 硬度和出汁率的測定

筍體中部硬度參考汪開拓等[13]方法采用TA-XT2i型質構儀進行測定，結果以N/cm2表示。出汁率參考CAO等[14]的方法，將筍體組織圓盤(直徑6 mm、高8 mm)置于已經稱量的塞有無菌棉的50 mL離心管(m1)中，筍體圓盤及m1質量共計為m2，于2 000×g離心20 min后，對僅裝有筍體組織的離心管稱重(m3),并按公式(1)計算出汁率：

(1)

1.3.2 褐變指數及失重率的測定

褐變度的測定參考JIANG等[15]的方法，略有調整。稱取2 g鮮筍肉，研磨后加入10 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS，pH 7.5)，充分勻漿后10 000×g離心25 min(4 ℃)，于410 nm處測定上清液吸光值，并以吸光值表示樣品褐變度。失重率采用差重法進行測定，并根據公式(2)計算失重率:

(2)

1.3.3 可溶性固形物(toatl soluble solid,TSS)、游離蛋白、抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力的測定

筍體TSS和游離蛋白含量參考楊光等[16]的方法進行測定，AsA含量參考鄰菲羅啉比色法[17]進行測定，TSS、游離蛋白、抗壞血酸含量分別以溶質的質量百分比(%)、mg/g FW、μg/g FW表示；DPPH自由基清除能力的測定參照RUFINO等[18]的方法，結果按自由基清除百分率來表示。

1.3.4 木質素及纖維素含量的測定

木質素和纖維素含量按照CAO等[14]的方法進行測定，結果均以g/kg FW表示。

1.3.5 可溶性糖組分及UDPG含量的測定

取5 g凍樣于液氮下研磨并用30 mL體積分數95%冷乙醇反復萃取3次，萃取液于10 000×g離心15 min(4 ℃)。合并上清液并于旋轉蒸發儀(37 ℃)進行真空濃縮，將蒸干后的殘留物溶于去離子水，再經0.45 μm的纖維膜微濾后分別按照WILSON等[19]和GOULARD等[20]的HPLC分析法對樣品中可溶性糖組分及UDPG含量進行測定。流動相由乙腈(A，75%)和去離子水(B，25%)組成，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，柱溫35 ℃。HPLC裝備Zorbax糖分析柱(250 mm×4.6 mm，10 μm填料粒徑)。以外標法計算樣品中可溶性糖組分及UDPG含量，結果均以mg/g FW表示。

1.3.6 蔗糖及苯丙烷類代謝途徑關鍵基因表達量測定

取5 g凍樣于液氮充分研磨后用RNAprep Pure Kit提取總RNA，再使用HiScript III RT試劑盒將RNA反轉錄為cDNA第一條鏈。參照蔗糖合酶分解方向(SS1)、蔗糖合酶合成方向(SS2)、蔗糖磷酸合酶(SPS)、磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酰CoA連接酶(4CL)、肉桂醇脫氫酶(CAD)、阿魏酸5-羥化酶(F5H)、咖啡酰CoA-O-甲基轉移酶(CCOMT)和過氧化物酶(POD)基因序列設計特異性引物(表1)，以單鏈cDNA為模板，以管家基因Actin為內參照進行SYBR Green實時熒光定量PCR(qPCR)試驗。根據各基因的循環閾值(Ct值)用定量法(2-ΔΔCt)分析各基因mRNA表達豐度，將對照表達量設置為1以校準各基因的相對表達量[21]。

表1 相關基因特異性引物序列Table 1 Sequences of the gene primers used in this study

1.4 數據分析

數據采取Duncan多重比較法(SPSS 13.0)進行差異顯著性檢驗，5%記錄為顯著水平(P<0.05)，并用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 外源果糖處理對冷藏雷竹筍硬度、出汁率、褐變度和失重率的影響

如圖1所示，雷竹筍在冷藏期間硬度、失重及筍體褐變情況呈現出逐漸上升的趨勢，而出汁率則逐漸下降，表明冷藏期間雷竹筍木質化敗壞癥狀逐漸加劇。10、20或30 mmol/L果糖處理對雷竹筍硬度、失重率和褐變度的上升，以及出汁率的降低有顯著(P<0.05)的延緩作用，其中20 mmol/L果糖處理效果最為明顯；4 ℃下貯藏20 d后，經20 mmol/L果糖處理的雷竹筍硬度、失重及褐變度僅為對照的76%、68%和79%，而出汁率則為對照的1.57倍。但40 mmol/L果糖處理反而加劇了筍體木質化敗壞的癥狀。

圖1 外源果糖處理對冷藏雷竹筍硬度(a)、出汁率(b)、褐變度(c)及失重率(d)的影響Fig.1 Effects of fructose treatments on the firmness (a),extractable juice rate (b),degree of browning (c) and rate ofweight loss (d) in bamboo shoots (Phyllostachys praecox) during cold storage

2.2 外源果糖處理對冷藏雷竹筍品質參數的影響

如表2所示，采用10或20 mmol/L果糖處理可有效提高冷藏雷竹筍游離蛋白和抗壞血酸含量，并增強筍體DPPH自由基清除能力，其中20 mmol/L較10 mmol/L果糖處理效果更為顯著。在冷藏結束時，經30或40 mmol/L果糖處理的雷竹筍中抗壞血酸含量顯著(P<0.05)高于對照水平，并且經30 mmol/L果糖處理的雷竹筍游離蛋白含量也顯著(P<0.05)高于對照水平，但DPPH自由基清除率與對照相比無顯著(P>0.05)差異。此外，10～30 mmol/L果糖處理均顯著(P<0.05)提高了冷藏雷竹筍TSS含量。

表2 外源果糖處理對雷竹筍冷藏20 d后品質參數的影響Table 2 Effects of fructose treatments on the quality parameters in bamboo shoots after 20 d of cold storage

2.3 外源果糖處理對冷藏雷竹筍木質素及纖維素含量的影響

如圖2所示，雷竹筍木質素和纖維素含量隨冷藏時間延長而逐漸上升，外源果糖處理(10、20或30 mmol/L)抑制了冷藏期間雷竹筍木質素及纖維素的積累，40 mmol/L果糖處理反而加速了筍體木質素及纖維素的積累。冷藏20 d后，40 mmol/L果糖處理的雷竹筍木質素及纖維素含量分別上升至冷藏前的2.71和3.37倍，而20 mmol/L果糖處理組僅上升至冷藏前的1.82和1.95倍。

圖2 外源果糖處理對冷藏雷竹筍木質素(a)及纖維素含量(b)的影響Fig.2 Effects of fructose treatments on the contents of lignin(a) and cellulose (b) in bamboo shootsduring cold storage

2.4 外源果糖處理對冷藏雷竹筍可溶性糖組分及UDPG含量的影響

雷竹筍在4 ℃貯藏期間，葡萄糖及果糖含量在前5 d逐漸下降，隨后呈現上升趨勢；蔗糖含量持續積累；而UDPG在前10 d逐漸上升，隨后緩慢降低(圖3)。40 mmol/L果糖處理加劇了雷竹筍冷藏期間可溶性糖組分及UDPG含量的變化；經外源果糖處理(10、20或30 mmol/L)的雷竹筍中葡萄糖、果糖和蔗糖含量在整個冷藏期間均顯著(P<0.05)高于對照，然而其UDPG含量則低于對照，其中20 mmol/L果糖處理的冷藏雷竹筍中可溶性糖組分及UDPG含量與對照間的差異最為顯著(P<0.05)。

2.5 外源果糖處理對冷藏雷竹筍蔗糖代謝關鍵基因表達量的影響

蔗糖合酶合成方向(SS2)可催化果糖和UDPG合成蔗糖，同時SPS可將UDPG和6-磷酸果糖合成為6-磷酸蔗糖，再經SPP的作用最終降解形成蔗糖；另一方面，蔗糖可經蔗糖合酶分解方向(SS1)的作用分解為葡萄糖和果糖，并經由糖轉運蛋白轉運至胞內[22]。如圖4所示，外源果糖處理(10、20或30 mmol/L)誘導了冷藏雷竹筍PpSS1表達量的下調，并顯著(P< 0.05)上調了PpSS2、PpSPS、PpSPP表達量，其中20 mmol/L果糖處理對雷竹筍冷藏期間蔗糖代謝關鍵基因表達量的調控作用最為顯著(P<0.05)；而40 mmol/L果糖處理對冷藏雷竹筍蔗糖代謝關鍵基因的調控與10、20或30 mmol/L果糖處理恰好相反。

圖3 外源果糖處理對冷藏雷竹筍葡萄糖(a)、果糖(b)、蔗糖(c)及UDPG含量(d)的影響Fig.3 Effects of fructose treatments on the contents of glucose (a),fructose (b),sucrose (c) and UDPG (d) in bambooshoots during cold storage

圖4 外源果糖處理對冷藏雷竹筍PpSS1(a)、PpSS2(b)、PpSPS(c)和PpSPP(d)表達豐度的影響Fig.4 Effects of fructose treatments on the expression levels of PpSS1 (a),PpSS2 (b),PpSPS (c) andPpSPP (d) in bamboo shoots during cold storage注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

2.6 外源果糖處理對冷藏雷竹筍苯丙烷類代謝關鍵基因表達量的影響

木質素的合成途徑主要由苯丙氨酸途徑和木質素合成的特異途徑所組成，其中PAL作為苯丙烷途徑的關鍵限速酶;4CL位于苯丙氨酸生物合成途徑的分支點，主要參與次生代謝產物合成并調控植物木質素代謝;CAD、CCOMT能催化木質素前體物質轉化為木質素單體;F5H主要調控木質素單體的生物合成;POD是催化木質素生物合成途徑最后一步的關鍵酶，這幾種酶與木質素的合成密切相關[11]。如圖5所示，外源20 mmol/L果糖處理顯著(P<0.05)下調了冷藏雷竹筍苯丙烷類代謝關鍵基因(PpPAL、Pp4CL、PpCAD、PpF5H、PpCCOMT和PpPOD)的表達量；10或30 mmol/L果糖處理也一定程度誘導了苯丙烷類代謝關鍵基因表達量的下調；而40 mmol/L果糖處理對雷竹筍冷藏前10 d內苯丙烷類代謝關鍵基因的表達有促進作用。

圖5 外源果糖處理對冷藏雷竹筍PpPAL(a)、Pp4CL(b)、PpCAD(c)、PpF5H(d)、PpCCOMT(e)和PpPOD(f)表達豐度的影響Fig.5 Effects of fructose treatments on the expression abundance of PpPAL (a),Pp4CL (b),PpCAD (c),PpF5H(d),PpCCOMT (e) and PpPOD (f) in bamboo shoots during cold storage

3 討論

3.1 最適果糖處理濃度的篩選

可溶性糖作為果蔬感官品質的主要物質來源，與果蔬采后生理、功能性或營養成分、風味、呈色等重要品質參數密切相關；并作為植物體中能量來源和滲透調節物質，具有為各種代謝過程提供前體物質的功能[23]。相關研究表明，采后蔗糖處理可有效降低青花菜線粒體膜電位并阻止細胞色素C從線粒體中釋放，從而延緩青花菜程序性死亡進程和生理衰老[24]；蔗糖或葡萄糖處理則可維持青花菜中葉綠體超微結構的完整性，抑制葉綠素降解相關酶基因表達，延緩葉綠素降解，抑制花蕾黃化癥狀的發展[12,25]；可溶性糖(蔗糖、果糖和葡萄糖)復合處理則能上調擬南芥花色苷合成相關基因的表達，促進花色苷的合成[26]。在這些研究中，果糖及其他可溶性糖既能直接通過蔗糖代謝來實現對果蔬品質的調控，也可作為激發子來誘導糖代謝關鍵酶(如己糖激酶)活性以啟動下游酶蛋白的磷酸化作用，從而延緩生理衰老進程或促進次生代謝產物合成。本研究中，在所有處理濃度中，20 mmol/L果糖處理可最為顯著地抑制雷竹筍冷藏期間木質素和纖維素的積累，延緩筍體硬度、失重率和褐變度的上升，并提高出汁率(圖1和2)；在冷藏結束的時候，經20 mmol/L果糖處理的雷竹筍中TSS、游離蛋白、抗壞血酸含量及自由基清除能力均顯著高于其他濃度處理或對照水平(表2)。因此，20 mmol/L果糖處理可有效抑制雷竹筍木質化敗壞進程，減慢筍體品質劣變速度，從而延長冷藏周期。由于果糖處理可使蔗糖代謝偏向于合成方向從而大量消耗UDPG，因此可減少木質素底物含量，進而限制雷竹筍木質素的合成[22]。另有研究發現，果糖處理能直接誘導費菜中苯丙烷類代謝酶活性的上升，并提高類黃酮合成量和抗氧化活性[27]，這可能與果糖處理直接誘導己糖激酶基因的表達，并促進苯丙烷類代謝途徑關鍵酶的活化有關。

3.2 果糖處理抑制雷竹筍木質素敗壞的機理分析

植物木質素為多種苯丙烷單體的共聚物，其單體主要通過苯丙烷類代謝途徑，以L-苯丙氨酸為底物合成中間體UDPG，再經羥基化、甲基化和連接反應最終生成；該途徑的主要酶系有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酰CoA連接酶(4CL)、咖啡酰CoA-O-甲基轉移酶(CCOMT)、阿魏酸5-羥化酶(F5H)、肉桂醇脫氫酶(CAD)、過氧化物酶(POD)[5]。蔗糖或己糖是果實中碳水化合物運輸的主要形式，常被用來研究對果實生長發育和基因表達的調控作用。蔗糖代謝相關酶活性與果實可溶性糖積累之間存在密切聯系，其中包括蔗糖合酶(SS)、蔗糖磷酸合酶(SPS)和磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)等酶系[22]；UDPG則在蔗糖代謝途徑中作為單糖基合成蔗糖或作為供體分解為單糖[28]。對模式植物擬南芥的研究表明，當植株受到病原菌侵染時，其組織中UDPG急劇消耗以合成植保素或花色苷類等抗菌物質，控制病害癥狀的發展[29]。因此，苯丙烷類次生代謝產物與蔗糖在合成路徑上存在對底物UDPG的競爭。在本研究中，當施加外源果糖處理后，雷竹筍蔗糖代謝途徑中的PpSS2(合成方向)、PpSPS和PpSPP基因表達量在整個冷藏期間顯著上調而PpSS1(分解方向)基因表達量顯著下調(圖4)，使蔗糖代謝通路偏向于合成方向，從而引起筍體蔗糖含量上升和UDPG含量下降(圖3)；同時，筍體苯丙烷類代謝途徑中主要關鍵酶基因(PpPAL、Pp4CL、PpCAD、PpF5H、PpCCOMT和PpPOD)表達豐度在貯藏期間均顯著下降(圖5)，并伴隨著木質素合成量的下降，這極有可能是由于UDPG過度用于蔗糖合成從而對木質素合成底物產生競爭性消耗。前期研究也證實，葡萄懸浮細胞經高濃度苯丙噻唑硫代乙酸甲酯或β-氨基丁酸處理后，其細胞內蔗糖分解酶活性顯著上升，分解出UDPG以供給茋類植保素和花色苷的合成，從而降低細胞中可溶性糖含量和細胞生長速率[10,30]。這些結果說明，外源果糖處理可通過調控蔗糖代謝的方式來降低UDPG含量，從而減少雷竹筍中木質素生成量，減輕冷藏周期內筍體木質化敗壞癥狀，延長貯藏周期或貨架期。

4 結論

20 mmol/L果糖噴淋處理可有效抑制雷竹筍冷藏期間筍體硬度上升、褐變和少汁等木質化敗壞癥狀的發生，降低筍體失重率，維持較高的出汁率和感官品質，從而有效延長雷竹筍冷藏周期。20 mmol/L果糖處理可通過調控雷竹筍蔗糖代謝途徑的方式，競爭性抑制筍體木質素的合成，但果糖在此過程中是否發揮其他的調控功能(如己糖信號分子作用)仍有待研究。