牦牛乳硬質干酪體外消化前后ACE抑制肽分析

宋雪梅，梁琪*，宋國順,張炎

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州，730070)

高血壓現已成為全球性的主要健康風險，它能引起心腦血管疾病、心力衰竭和終末期腎臟病等。據統計，因高血壓引發的心腦血管疾病至少占到了整個心腦血管疾病的50%[1]。血壓受不同生化途徑調控，腎素-血管緊張素-醛固酮系統和舒血管素-激肽系統是其中的主要調節系統。血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)是這些血壓調節系統中的關鍵酶，它能促進血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，降解緩激肽為無活性片段，從而導致血壓升高。因此，通過抑制ACE活性，有助于降低機體血壓。然而，化學合成的ACE抑制劑對人體具有副作用。一些源自牛乳[2]、小麥[3]、肉[4]等的食源性多肽,因安全，易與ACE結合、反應等特性，備受研究者關注。

干酪是重要的發酵乳制品，富含蛋白質和復雜多樣的蛋白酶。成熟干酪中酪蛋白經凝乳酶、微生物蛋白酶、肽酶等作用，逐級降解為多肽，這些多肽不僅參與干酪風味、滋味和質地等形成，而且部分多肽還具有生物活性。Cheddar[5]、Gouda[6]、Emmental等[7]干酪的水溶性提取物已發現具有ACE抑制作用。GMEZ-RUIZ等[8]從成熟8個月的綿羊乳Manchego干酪的水溶性提取物中分離、鑒定出ACE抑制肽。Cheddar干酪中鑒定的VPP和IPP,對小鼠和人類具有降血壓作用[9]。

牦牛乳硬質干酪富含蛋白質，前期發現其水溶性提取物中含有生物活性多肽[10]。生物活性多肽經胃腸液消化、吸收，達到心血管系統后，才能發揮作用。生物活性多肽的化學結構信息與其生物活性密切相關，多肽的氨基酸組成和序列信息對其生物活性具有重要影響。因此，本試驗使用胃蛋白酶和胰蛋白酶，模擬體外胃腸液消化，運用液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術，基于已報道的ACE抑制肽結構和活性關系，進一步比較牦牛乳硬質干酪經消化酶降解前后ACE抑制肽差異，為開發出具有功能特性的牦牛乳硬質干酪提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

牦牛乳，甘肅省天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉；CHOOZIT型乳酸菌發酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)，丹麥丹尼斯克公司；小牛凝乳酶(酶活力10萬U/g)，蘭州生物技術有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)、血管緊張素轉換酶、甲酸(質譜級)，美國Sigma-Aldrich公司；胃蛋白酶(USP級，1∶30 000)、胰蛋白酶(生物試劑純，1∶250，250 U/mg，USP級)， 上海源葉生物科技有限公司；乙腈(質譜級)，美國Fisher Chemical公司。

1.2 儀器與設備

自制干酪槽；真空包裝機,廣東中山市名康包裝機械廠；TGL-20 高速臺式冷凍離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司；Scientz-10ND真空冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司；723紫外可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司；Ultimate 3000毛細管高效液相色譜儀、Quadrupole-Orbitrap質譜儀,美國Thermo Fishier Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干酪制作

參考劉興龍等[11]的方法，適當微調，具體工藝流程如下：

原料乳→檢驗→巴氏殺菌(60 ℃、30 min)→冷卻至32 ℃→添加發酵劑(10 g/L原料乳)→添加CaCl2(0.3 g/L原料乳)→添加凝乳酶→凝乳(40 min)→切割→排乳清→二次加熱(溫度緩慢從35 ℃升到45 ℃)→排乳清→攪拌、加鹽(20 g/kg凝乳塊)→堆釀→壓榨成型→真空包裝→15 ℃下成熟6個月該成熟牦牛乳硬質干酪水分質量分數為40.8%，蛋白質質量分數為27.22%，脂肪質量分數為45.9%。最后，將貯藏于-18 ℃備用。

1.3.2 干酪水溶性多肽的提取

參考RIZZELLO等[12]的方法提取。以1∶3(g∶mL)加入磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)，150 r/min，40 ℃恒溫振蕩1 h后，4 ℃、4 200 r/min離心30 min，除去上層脂肪后，用Whatman No.2濾紙真空過濾，將濾液pH值調至4.6，4 ℃、7 500 r/min離心10 min，即獲得上清液。真空冷凍干燥，于-18 ℃儲藏備用。

1.3.3 干酪水溶性多肽的體外消化

參考LO等[13]的方法進行體外試驗。配制30 g/L的干酪水溶性多肽溶液10 mL，用1 mol/L鹽酸將pH調節為2.0，加入適量胃蛋白酶，使其質量分數為4%，搖動、恒溫(37 ℃)反應2 h，沸水浴5 min。使用0.9 mol/L NaHCO3將溶液pH調節為5.0，再用1 mol/L NaOH將溶液pH調節為7.5，加入適量胰蛋白酶， 使其質量分數為4%，搖動、恒溫(37 ℃) 反應2 h，沸水浴滅酶5 min，最后，取上清液進行后續試驗。

1.3.4 ACE抑制活性測定

參考CUSHMAN等[14]的方法，采用分光光度法進行測定。5 mmol/L的HHL溶液與40 μL ACE 抑制肽混合(緩沖溶液作為空白樣品)，37 ℃水浴預熱53 min后，加入0.1 U/mL ACE溶液20 μL，繼續37 ℃水浴反應30 min。隨后加入1 mol/L HCl溶液100 μL終止反應。將各試劑依次加入5 mL離心管中并混勻，待反應結束后，加入1.7 mL乙酸乙酯萃取馬尿酸，經15 s振蕩、混勻后離心(4 000 r/min，15 min，4 ℃)，吸取1.0 mL乙酸乙酯層于小試管中，放在100 ℃水浴鍋中15 min，之后加入3 mL去離子水于試管中，228 nm處測定吸光度，按公式(1)計算：

(1)

式中：A,反應中ACE抑制肽與ACE同時存在的吸光度值；B,反應中沒有ACE抑制肽的吸光度值；C,反應中ACE和HHL空白反應的吸光度值。

1.3.5 采用LC-MS/MS進行多肽分析

色譜條件：Acclaim PepMap Rplc C18(1.9 μm×150 μm×150 mm)色譜柱；流動相A 0.1%(體積分數，下同)甲酸，2%乙腈；流動相B 0.1%甲酸，80%乙腈。梯度洗脫程序：0～8 min(6%～9%流動相B)；8～24 min(9%～14%流動相B)；24～60 min(14%～30%流動相B)；60～75 min(30%～40%流動相B)；75～78 min(40%～95%流動相B)；流速600 nL/min。

質譜條件：一級質譜參數分辨率70 000；AGC目標3e6；一級最大注射時間40 ms；掃描范圍m/z300～1 600；二級質譜參數分辨率75 000；AGC目標1e5；一級最大注射時間60 ms。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel和SPSS 19.0進行作圖和試驗數據處理。如果方差分析差異顯著，用Duncan法進行多重比較。質譜原始數據采用Maxquant(1.6.2.10)檢索目標蛋白數據庫。檢索參數為可變修飾為N段乙酰化(N-acetyl)、甲硫氨酸氧化[Oxidation(M)]；半胱氨酸固定化修飾為氨基甲酰化[Carbamidomethyl (C)]；一級質譜誤差為6 ppm；二級質譜誤差為20 ppm；遺漏酶切位點為2；顯著性閾值為0.01。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳硬質干酪水性多肽體外消化前后ACE抑制活性比較

牦牛乳硬質干酪水溶性多肽經胃蛋白酶、胰蛋白酶降解前后的ACE抑制活性比較見圖1。從圖1可知，干酪經消化酶降解后，其ACE抑制率降低了13.06%，這說明消化酶對干酪水溶性多肽的ACE抑制活性具有一定影響。但是與消化前干酪水溶性多肽ACE抑制活性間無顯著性差異(P>0.05)，這表明干酪水溶性多肽經胃蛋白酶、胰蛋白酶作用后，其ACE抑制活性基本保持穩定。

圖1 牦牛乳硬質干酪水溶性多肽體外消化前后ACE抑制活性比較Fig.1 Comparison of the ACE-inhibitory activity of water-soluble extract of hard cheese made from yak milk andin vitro digest

2.2 牦牛乳硬質干酪水溶性多肽體外消化前后質譜分析

為了確定牦牛乳硬質干酪體外消化前后，對ACE起抑制作用的多肽，本試驗采用毛細管液相色譜結合Quadrupole-Orbitrap質譜儀對干酪中水溶性多肽和消化酶降解物進行了分離、鑒定(總離子流色譜原圖見增強出版)。

牦牛乳硬質干酪水溶性多肽和其消化酶降解物較為復雜。通過Maxiquant 軟件對所得質譜圖與蛋白質數據庫中蛋白質序列進行比對，肽段分數越高，肽段豐度越強，所得肽段越可靠。因此，依據多肽分值和豐度，鑒定出消化前后牦牛乳硬質干酪水溶性多肽分別為36和23種，具體結果見表1和表2。

從表1可知，牦牛乳硬質干酪中源自аs1-酪蛋白、аs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的多肽分別為8、2、25和1種，源自аs1-酪蛋白和β-酪蛋白的多肽占總肽數量的91.67%。多肽氨基酸殘基數為7～25個，其中氨基酸殘基數為7～13個的多肽占總肽數量的41.67%。另外，發現一些多肽如KEDVPSERYL、KEDVPSERYLG、KEDVPSERYLGY等[23]之間存在相互關系，這主要與干酪中作用于蛋白質的多樣和復雜的蛋白質降解酶有關。

從表2可知，牦牛乳硬質干酪中源自аs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的多肽分別為4、18和1種，其中，源自аs1-酪蛋白和β-酪蛋白的多肽占總肽數量的95.65%。多肽氨基酸殘基數為7～14個，氨基酸殘基數為7～13個的多肽占總肽數量的95.83%。牦牛乳硬質干酪經消化酶作用后，其水溶性多肽中長鏈肽減少，短鏈肽增多。

表1 牦牛乳硬質干酪中水溶性多肽Table 1 Water-soluble peptides of hard cheese made from yak milk

表2 牦牛乳硬質干酪體外消化后水溶性多肽Table 2 Water-soluble peptides of hard cheese made from yak milk after in vitro digestion

續表2

ACE抑制肽是ACE的競爭性底物，其多肽結構和ACE活性相互關系顯示，其C-末端含有疏水性氨基酸殘基時，更傾向與ACE的催化位點結合。結合表1和表2，干酪中25種多肽C-末端含有疏水性氨基酸如脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸如色氨酸(Trp)等。干酪消化后14種多肽C-末端含有疏水性氨基酸如Leu、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和堿性氨基酸如賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等。更為重要的是，干酪消化前后與已報道的ACE抑制肽具有一定同源性的多肽分別為29和13種，分別占總肽數量的80.56%和56.52%，這說明牦牛乳硬質干酪的水溶性多肽和消化酶降解物中存在較多ACE抑制肽。ACE抑制肽C-末端三肽的氨基酸組成對抑制ACE活性影響最大[16]，進一步分析發現，消化前后牦牛乳硬質干酪水溶性多肽C-末端三肽的序列與已確定ACE抑制肽相同的分別占總肽數量的36.11%和30.43%，這些多肽有助于消化前后干酪對ACE的抑制作用。

2.3 牦牛乳硬質干酪體外消化前后ACE抑制肽質譜分析

依據ACE抑制肽C-末端特征、肽鏈長度以及文獻所報道的ACE抑制肽，牦牛乳硬質干酪體外消化前后共鑒定出ACE抑制肽分別為15、12種，詳細ACE抑制肽序列和特征見表3。

從表3可知，牦牛乳硬質干酪體外消化前后ACE抑制肽主要源自β-酪蛋白，相同ACE抑制肽3種，大多數ACE抑制肽由8～12個氨基酸組成，分子質量在800～1 500 Da。ACE抑制肽一般含有2～12個氨基酸殘基[26]，因此，大多數ACE抑制肽鏈長度在此范圍內。多肽C-末端三肽氨基酸分別為疏水性氨基酸如酪氨酸(Tyr)、Phe、Trp、丙氨酸(Ala)、Ile、Leu、Val和 Met或者帶正電的氨基酸如Arg、Lys以及Pro時，該肽能很好地與ACE結合[27]，如干酪消化前后的PVLGPVRGPFP、TDVENLHLPLPL、TDVENLHLPLPLL、VENLHLPLPLL、KEDVPSERYL、QEPVLGPVRGPFP、VLGPVRGPFPIIV、PVLGPVRGPFPIIV、YQEPVLGPVRGPFPI、YQEPVLGPVR等的C-末端三肽氨基酸具有以上特征。源自牦牛乳酪蛋白降解物LPLPLL具有ACE抑制活性,其半抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)為10.46 μmol/L[19]，而TDVENLHLPLPLL、VENLHLPLPLL的C-端共享了此部分序列。

ACE抑制肽的C-端氨基酸組成對其發揮ACE抑制作用具有重要影響。消化前牦牛乳硬質干酪中源自β-酪蛋白的PVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFP、QEPVLGPVRGPFP和KEDVPSERYLGY的C-末端為Pro或Tyr，該結構易于和ACE結合。干酪中KEDVPSERYL、KEDVPSERYLG、KKYKVPQL與已報道ACE抑制肽VPSERYL、KKYNVPQL(IC50為77.1 μmol/L)[9]存在相同片段。牦牛乳硬質干酪中VLGPVRGPFPIIV、PVLGPVRGPFPIIV與Cheddar干酪中ACE抑制肽YQEPVLGPVRGPFPIIV[5]以及干酪中SQSKVLPVPQ與SKVLPVPQ在多肽C-末端具有高度相似性，而SKVLPVPQ(IC50為39 μmol/L)已證實具有較強ACE抑制活性[17]。干酪中YQEPVLGPVRGPFPI和QEPVLGPVRGPFP已報道具有ACE抑制活性[6,9,28]。

表3 牦牛乳硬質干酪中體外消化前后ACE抑制肽Table 3 ACE-inhibitory peptides from hard cheese made from yak milk before and after simulatedgastro-intestinal digestion.

牦牛乳硬質干酪消化后的LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN是非常具有潛力的 ACE抑制肽，它們的抑制活性已分別在山羊乳Kefir[29]及源自β-酪蛋白消化酶產物中被證實[30]。Gouda干酪中發現的YPFPGPIPN[6]和源自牦牛乳酪蛋白的PFPGPIPN對ACE的IC50分別14.8和12.79 μmol/L[19]，且YPFPGPIPN對隨機高血壓鼠具有降壓作用[6]，因此，消化后牦牛乳硬質干酪中的LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN具有較強ACE抑制作用。多肽C-末端含有賴氨酸(K)時[31]，該肽也具有抑制作用，如干酪消化后的源自β-酪蛋白的KVLPVPQK。干酪消化后的VVPPFLQPEVM、PVVVPPFLQPEVM與源自酸奶的PPFLQPEVM(IC50為34.63 μmol/L)[25]共享了C-端氨基酸序列。另外，多肽N-端為脂肪族氨基酸如Ala、Val、Leu和Ile時，能有效與ACE結合[32]。因此，這些肽具有潛在ACE抑制活性。消化后牦牛乳硬質干酪中KVLPVPQK與發酵乳中ACE抑制肽KVLPVPQ、VLPVPQK高度共享了部分序列[20]。消化后干酪中YQEPVLGPVR已證實具有ACE抑制活性[24]。

綜上所述，牦牛乳硬質干酪消化前后鑒定的大多數ACE抑制肽具備了抑制ACE活性的結構特征，干酪消化前后分別有10和8種ACE抑制肽與已報道ACE抑制肽共享了C-末端三肽氨基酸特征，干酪中SKVLPVPQ、QEPVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFPI和干酪消化后LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN、YQEPVLGPVR已確定具有ACE抑制活性。

3 討論

成熟短期到中長期干酪中水溶性提取物具有較強ACE抑制作用[33]，但是干酪水溶性提取物中ACE-I抑制肽經胃腸蛋白質酶降解后[7]，其潛在作用將發生變化。為此，結合前期試驗，本試驗以15 ℃成熟6個月的牦牛乳硬質干酪中水溶性多肽為研究對象，發現牦牛乳硬質干酪中1種ACE抑制肽源自аs1-酪蛋白，13種源自β-酪蛋白，1種源自аs2-酪蛋白，經胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后，11種ACE抑制肽源自β-酪蛋白，1種源自κ-酪蛋白。GOMEZ-RUIZ等[34]利用高效液相色譜-質譜串聯技術在不同西班牙干酪中鑒定出ACE抑制肽41種，且大部分來自β-酪蛋白和аs1-酪蛋白。酪蛋白含有豐富的脯氨酸，乳酸菌擁有特異性脯氨酸肽酶，因此，干酪中ACE抑制肽主要來源于β-酪蛋白和аs1-酪蛋白[33]。

牦牛乳硬質干酪中ACE抑制肽為其具有ACE抑制活性提供了可能。但是，不同ACE抑制肽在胃腸液中的存在能力不同[9]。胃蛋白酶特異性較低，主要水解多肽氨基端或羧基端為芳香族氨基酸或者疏水性氨基酸，而胰蛋白酶特異性酶切位點主要傾向于堿性氨基酸如Arg或者Lys。干酪中YQEPVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFPI、YQEPVLGPVRGPFPII經消化酶作用后，轉化為YQEPVLGPVR。干酪中KVLPVPQKAVPYPQ、SKVLPVPQKAVPYPQ、SKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQ、SQSKVLPVPQKAVPYPQ、SQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQ等轉化為KVLPVPQK，這說明牦牛乳硬質干酪中ACE抑制肽，甚至活性較弱或者沒有活性的多肽經胃胰蛋白酶消化后能夠轉化為其他ACE抑制肽。B.bifidumMF 20/5發酵乳中LVYPFP經胃蛋白酶水解后，也產生了具有更強ACE抑制活性的多肽[35]。

牦牛硬質干酪中ACE抑制肽15種，經消化酶降解后，干酪中ACE抑制肽變為12種，且大多數ACE抑制肽種類不同。這說明，消化酶對干酪中ACE抑制肽種類有影響。STUKNYTE等對比了不同干酪中的8種ACE抑制肽，研究發現，經體外胃腸消化后，Cheddar、Gorgonzola、Maasdam、Grana Padano等干酪中只存在VPP、IPP、HLPLP、LHLPLP等4種ACE抑制肽[36]。Emmental 干酪中具有ACE-I活性的多肽經胃蛋白酶和胰蛋白水解后，ACE抑制活性分別降低了(33±13)%和(32±13)%[7]。本試驗發現牦牛乳硬質干酪經體外消化后其ACE抑制活性與消化前無顯著性差異。一方面，可能與牦牛乳硬質干酪消化后活性較強ACE抑制肽的生成量有關；另一方面，也可能存在干酪消化后ACE抑制肽的協同效應，因此，還需要進一步對牦牛乳硬質干酪消化前后ACE抑制活性強的多肽進行深入研究。

4 結論

牦牛乳硬質干酪鑒定出ACE抑制肽15種，經胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后，ACE抑制肽為12種。大多數ACE抑制肽源自β-酪蛋白，分子質量為 800～1 500 Da。相同ACE抑制肽3種，大多數ACE抑制肽不同。通過詳細對ACE抑制肽氨基酸組成分析，發現干酪體外消化前后的大多數ACE抑制肽具備抑制ACE活性的結構特征，干酪消化前后分別有10和8種ACE抑制肽與已報道ACE抑制肽共享了其C-末端的三肽氨基酸，它們是潛在ACE抑制肽。其中，干酪中SKVLPVPQ、QEPVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFPI和干酪消化后LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN、YQEPVLGPVR確定具有ACE抑制活性。干酪水溶性多肽與其經胃蛋白酶和胰蛋白酶降解的酶解物的ACE抑制活性間無顯著性差異(P>0.05)，這為開發具有保健功能特性的牦牛乳硬質干酪提供了理論依據。