羅非魚副產物抗菌肽的制備及其對無乳鏈球菌抑菌活性分析

岑劍偉，趙敏，楊賢慶，李來好，黃卉，趙永強，魏涯，楊少玲，林織

1(中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州，510300)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 3(廣東順欣海洋漁業集團有限公司，廣東 陽江，529800)

抗菌肽是在所有生命類別中基本都具備的先天免疫系統的一部分，能夠對抗細菌、真菌、病毒以及腫瘤細胞等[1]，并具有生態友好性、低殘留、熱穩定好、抗菌譜廣以及不易產生耐藥性等優勢，在水產養殖中可以提高魚類的抗病性或保持食品不受微生物污染[2]，可作為理想的抗生素替代品，在飼料、食品以及醫藥等行業具有廣闊的應用前景[3-4]。

羅非魚(Oreochromisniloticus)由于具有快速生長、高繁殖率和高適銷性等優勢，已成為世界第二大常見養殖淡水魚類[5]。羅非魚加工產生約60%～70%(質量分數)的副產品，包括肌肉殘留物、頭部、內臟、皮膚、骨骼和鱗屑[6]。羅非魚副產物具備作為水產飼料原料的可行性，其水解物具有抗菌、抗氧化和抗高血壓等多種生物活性，在水產飼料中引入魚類副產物水解物可改善魚類生長性能[7]。盡管羅非魚養殖產業發展迅速，但也面臨由鏈球菌(Streptococcusspp.)、弧菌(Vibriospp.)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)等引起的細菌感染挑戰[8]。無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是與各種水生動物(特別是羅非魚)相關的重要病原體[9]，已成為中國羅非魚行業最嚴重的疾病問題之一，對羅非魚養殖產業造成巨大的影響[10]。有報道稱，羅非魚副產物酶解肽在體外對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)具有抗菌活性[11-12]。但關于抑制無乳鏈球菌的羅非魚副產物抗菌肽的研究尚未有報道。

本研究的目的在于通過蛋白酶水解羅非魚副產物制備抗菌肽，通過前期的蛋白酶及抑菌目標菌種探索得出，由酸性蛋白酶水解可獲得抑制無乳鏈球菌的抗菌肽，而無乳鏈球菌正是羅非魚養殖中迫切需要應對的一種致病菌，因此選擇無乳鏈球菌進行后續抑菌實驗。由單因素及正交試驗確定酸性蛋白酶酶解的最佳條件，抗菌活性依次通過瓊脂孔擴散法和微孔板檢測法在體外進行評估，并對羅非魚副產物酶解肽的氨基酸組成和分子質量分布進行測定，以評估其營養和功能特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

羅非魚，取羅非魚副產物(魚頭、魚骨、魚皮、內臟等)絞碎，置于聚乙烯袋內于-80 ℃凍藏備用，廣州華潤萬家超市；無乳鏈球菌，中國水產科學研究院南海水產研究所魚病室；木瓜蛋白酶(3 500 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、酸性蛋白酶(50 U/mg)、胃蛋白酶(10 000 U/mg)，合肥博美生物科技有限責任公司；Protamex (1.5 AU/g)、Alcalase 2.4 L(2.4 AU/g)，丹麥諾維信公司；腦心浸萃(brain heart infusion,BHI)瓊脂培養基、MH肉湯(mueller-hinton broth,MHB)培養基，廣州領馭生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

809Titrando自動電位滴定儀，瑞士萬通公司；Alpha1-4冷凍干燥機，德國Christ公司；Sunrise-basic吸光酶標儀，瑞士TECAN公司；3K30臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造廠；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器，日本雅馬拓公司；LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；WGZ-2XJ細菌濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；835-50型高速氨基酸自動分析儀，日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚副產物抗菌肽粗酶液提取中酶的篩選

取絞碎的羅非魚副產物解凍后以1∶2(g∶mL)加入去離子水均質至混合物，調整不同pH，選用酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Protamex和Alcalase 2.4 L蛋白酶分別酶解羅非魚副產物，在其最適條件下恒溫水浴振蕩不同時間，再經15 min沸水浴滅酶，冷卻后于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液進行抽濾、冷凍干燥后即得羅非魚副產物酶解肽粉末。6種蛋白酶的酶解條件見表1。然后取不同酶解條件的凍干肽粉末配制質量濃度為100 μg/μL的肽溶液，分別進行下述1.2.5中牛津杯法抑菌實驗，以及通過1.2.7中96孔板法測定各個酶解條件所得肽的抑菌活性。

表1 各類蛋白酶的酶解條件及添加量Table 1 Hydrolysis conditions and dosages of various proteases

1.2.2 單因素試驗

按照1.2.1中方法進行酶解，以對無乳鏈球菌的抑菌活性為指標，分別考察酸性蛋白酶的酶解時間(2、3、4、5、6 h)、酶解溫度(30、35、40、45、50 ℃)、酶解pH(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5)、料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)(g∶mL)以及酶添加量(質量分數0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%)對該指標的影響。固定條件：酶解時間5 h、酶解溫度為40 ℃、pH 2.0、酶添加量為0.6%(質量分數)、料液比1∶3(g∶mL)，每次改變其中1個因素，其他因素不變進行酶解，并對其進行1.2.3中水解度測定。然后取各酶解條件的凍干肽粉末配制質量濃度200 μg/μL的肽溶液進行下述1.2.5中抑菌實驗。

1.2.3 水解度測定

采用電位滴定法[13]測定氨基態氮質量濃度，凱氏定氮法[14]測定羅非魚副產物中的總氮質量濃度。

(1)

1.2.4 無乳鏈球菌菌懸液配制

取1環無乳鏈球菌接種至100 mL BHI液體培養基，30 ℃振蕩24 h培養菌液。在比濁管內用無菌水稀釋該菌液至其麥氏濁度值(McFarland，MCF)約為0.5(0.5 MCF相當于108CFU/mL)，然后稀釋2個梯度至106CFU/mL。

1.2.5 抑菌活性測定

采用牛津杯抑菌圈法[15]，在無菌條件下，將牛津杯置于培養皿中央，吸取1 mL 106CFU/mL的菌液于冷卻至50 ℃左右的100 mL滅菌BHI瓊脂培養基中搖勻，傾注平板(約20 mL/平板)后靜置。凝固后將牛津杯用鑷子垂直拔出，吸取配好的肽溶液約200 μL注入孔中。由于酶解過程中用到鹽酸，故于平板孔中注入等pH鹽酸作陰性對照，并添加質量濃度50 μg/mL的氯霉素溶液作陽性對照，等量無菌水作空白對照。將培養皿置于30 ℃培養箱中24 h后以游標卡尺用十字交叉法測量抑菌圈直徑，以此評價其抑菌活性。重復3次抑菌實驗取平均值。

1.2.6 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，以抗菌肽抑菌圈直徑為響應值，選擇對其影響較大的酶解時間、酶解溫度、料液比及酶添加量為4個因素，采用L9(34)正交實驗進行酶解條件的優化，因素水平設計見表2。

表2 正交試驗因素水平設計Table 2 Factors and levels for orthogonal array design

1.2.7 羅非魚副產物抗菌肽最小抑菌濃度測定

參考李朝等[16]方法，采用96孔板二倍稀釋法進行抑菌實驗，設實驗組為3個平行、陽性對照和陰性對照。預先于所有微孔中加入100 μL的MHB培養基，各組操作如下：實驗組為第1列微孔中加入100 μL配好的羅非魚副產物抗菌肽溶液，與預先添加的MHB培養基充分混合后，吸取100 μL混合液注入第2列，再次充分混合，逐級稀釋至最后1列時吸出100 μL棄去，最后于各微孔中添加100 μL菌液；陰性對照與其類似，第1列加入抗菌肽溶液，逐級稀釋后，于各微孔中添加100 μL無菌水；陽性對照為各微孔中注入100 μL菌液。

最后將微孔板于30 ℃下培養24 h后置于酶標儀中于600 nm波長下讀取吸光值，并根據吸光值確定該抗菌肽溶液對無乳鏈球菌的最小抑菌濃度(minimum inhibit concentration,MIC)值。

1.2.8 羅非魚副產物抗菌肽分子質量測定

采用高效體積排阻色譜(high-performance size-exclusion chromatography,HPSEC)法[17]測定羅非魚副產物抗菌肽的分子質量(molecular weight，MW)分布，流動相V(含1 g/L三氟乙酸的乙腈)∶V(含1 g/L三氟乙酸的超純水)=20∶80，色譜柱為TSK-GEL?G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)，流速0.5 mL/min，進樣體積10 μL，檢測波長214 nm，分別用流動相配制2 mg/mL的不同相對分子質量的標準樣品溶液：還原性谷胱甘肽(MW307.3)、L-氧化型谷胱甘肽(MW612.63)、桿菌肽(MW1422.69)、細胞色素C(MW12 500),按照一定比例混合后，用0.22 μm微孔濾膜過濾后進高效液相色譜儀，按照上述色譜條件進行分析，以相對分子質量的對數(lgMW)對保留時間(t)作圖，得到標準品色譜圖及分子質量回歸方程：lgMW=-0.180 2t+6.570 7，最后用峰面積歸一法計算多肽相對分子質量的分布情況。

1.2.9 酶解肽凍干粉氨基酸組成測定

按GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》中的酸水解法測定16種基本氨基酸[18]；按GB/T 18246—2019《飼料中氨基酸的測定》中的堿水解法測定色氨酸和氧化酸水解法測定胱氨酸[19]。

1.3 數據分析

利用Excel 2016和SPSS Statistics 22.0統計學軟件進行處理、分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

6種蛋白酶不同酶解條件所得肽溶液對無乳鏈球菌的吸光值測定結果如圖1所示。在酶解時間≥1 h時，酸性蛋白酶實驗組吸光值較低，與陰性對照基本一致，表明無乳鏈球菌的生長受到抑制；而胃蛋白酶酶解肽在時間≥2 h時的吸光值較低，此時無乳鏈球菌受到抑制。其他酶解條件實驗組吸光值與陽性對照一致，表明無乳鏈球菌正常生長。因此得出酸性蛋白酶和胃蛋白酶解肽對無乳鏈球菌的抑菌效果顯著優于其他蛋白酶。施永清等[ 20]以鯽魚魚鱗為原料通過堿性蛋白酶結合酸性蛋白酶分步酶解得到具有較強抑菌活性的抗菌肽，對副溶血性弧菌的抑菌圈直徑為27.72 mm。王焙等[21]以酸性蛋白酶酶解鰹魚暗色肉制備抗菌肽，其對大腸桿菌具有較好的抑菌效果，酸性蛋白酶的酶切作用范圍廣，主要作用于C端的某些疏水性氨基酸殘基，導致疏水性基團暴露，易水解出具有抑菌活性的多肽。再通過對二者抑菌圈直徑大小的比較(數據未顯示)，發現酸性蛋白酶的抑菌效果優于胃蛋白酶，因此選取酸性蛋白酶進行下一步的單因素酶解實驗。

圖1 各類蛋白酶酶解液對無乳鏈球菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of various protease hydrolysateson S. agalactiae

2.2 酸性蛋白酶單因素酶解羅非魚副產物抑菌試驗及水解度的測定

如圖2-a所示，隨酶解時間的延長，抑菌圈直徑和水解度均呈上升趨勢，5 h后無明顯增加，因此酶解5 h較佳。圖2-b表明，隨酶解溫度的升高，抑菌圈直徑和水解度均先升高后下降。溫度過高會引起酶變性失活，因此最佳溫度為40 ℃，符合酸性蛋白酶的最適溫度范圍。由圖2-c可知，pH 1.5時，抑菌圈直徑最大而水解度最小。通過等pH鹽酸的抑菌對照發現在pH值<1.5時酸性本身具有抑菌效果，因此為了排除其影響選取pH 2.0進行后續實驗。這與顧晨濤等[22]的試驗結果一致，通過胃蛋白酶酶解鯽魚魚鱗得到pH值為1.5的抗菌肽粗酶液。這可能是由于環境pH可直接影響酶活力，在特定pH下，酶分子才會與底物蛋白更好地結合。這說明該抗菌肽在酸性條件下更易發揮抗菌效果。如圖2-d所示，抑菌圈直徑隨酶添加量的增加而先增大后減小，這可能是由于酶量的增加抑制了底物擴散，反而使反應速率降低[23]，因此該酶的最佳添加量為0.8%(質量分數)。圖2-e表明，隨蒸餾水體積的增加，抑菌圈直徑逐漸增大，可能是副產物比例越低，酶解效果越好，得到的抑菌多肽數量越多，然而隨著水量繼續增加，與底物結合的酶添加量一定，酶解程度達到極限，從而抑菌效果上升不明顯，因此確定最適料液比為1∶4(g∶mL)。

2.3 正交試驗

通過單因素試驗發現4個因素在一定pH范圍內會對抑菌活性產生明顯影響，所以設計正交試驗時只考慮酶解時間、酶解溫度、料液比、酶添加量這4個因素。以抑菌圈直徑為指標，正交試驗的結果如表3所示。

a-酶解時間;b-酶解溫度;c-酶解pH;d-酶添加量;e-料液比圖2 酶解時間、溫度、pH、酶添加量和料液比對抑菌效果和水解度的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time，temperature，pH，enzyme dosage and solid-liquid ratio on antibacterial effectand the degree of hydrolysis

表3 L9(34)正交實驗設計及優化結果Table 3 L9(34) orthogonal experimental design andoptimization results

由極差R可知，各因素對抑菌圈直徑的影響順序依次為:酶解溫度>料液比>酶解時間>酶添加量，所選因素中溫度的影響較大。并得出最佳酶解條件為A2B2C3D1，即酶解時間5 h，酶解溫度40 ℃，料液比1∶5(g∶mL)，酶添加量0.7%(質量分數)，對得到的最佳酶解條件進行驗證，3組平行實驗得到抑菌圈直徑為23.38 mm。根據抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，直徑在15～20 mm為高敏，直徑在10～15 mm為中敏，直徑<10 mm為低敏的標準[24]，羅非魚副產物抗菌肽溶液質量濃度為200 μg/μL時，抑菌圈直徑為23.38 mm，表明無乳鏈球菌對該抗菌肽溶液極敏，在此質量濃度下具有良好的抑菌活性。

2.4 羅非魚副產物抗菌肽對無乳鏈球菌的MIC值

最優酶解條件所得多肽溶液對無乳鏈球菌的MIC實驗結果如圖3所示，當肽溶液質量濃度≥12.5 μg/μL時，實驗組與陰性對照的吸光值基本一致，表明無乳鏈球菌的生長受到抑制；當肽溶液質量濃度<12.5 μg/μL時，實驗組與陽性對照的吸光值基本一致，表明無乳鏈球菌正常生長。因此，該羅非魚副產物抗菌肽對無乳鏈球菌的MIC值為12.5 μg/μL。

圖3 羅非魚副產物抗菌肽對無乳鏈球菌的MIC值Fig.3 Minimum inhibitory concentration of tilapia by-product antibacterial peptides against S. agalactiae

2.5 羅非魚副產物抗菌肽分子質量分布

圖4-a為最優酶解條件所得羅非魚副產物多肽的HPSEC圖譜，其分子質量百分比分布如圖4-b所示。由圖4可知，該多肽組分主要由低分子質量級(<3 kDa)組成，占68.08%(質量分數)，表明酶解后羅非魚副產物蛋白質在很大程度上降解為小肽或游離氨基酸，該抗菌肽極有可能是小分子多肽。通常認為分子質量是決定肽生物活性的重要因素[25]，分子質量越小的短肽具有越好的水溶性，易于被人體腸胃吸收利用，尤其是一些寡肽由于氨基酸組成以及排列順序的不同，具有非常重要的生物活性[23]，而對于其中抑菌活性最佳組分分子質量的確定還有待進一步的分離純化探究。

a-HPSEC圖譜；b-各肽段分子質量所占百分比圖4 羅非魚副產物抗菌肽的分子質量分布Fig.4 Molecular weight distribution of antibacterial peptidesfrom tilapia by-products

2.6 羅非魚副產物酶解凍干粉蛋白氨基酸組成分析

除了多肽的分子質量大小，其氨基酸組成對抗菌活性也很重要。最優酶解條件所得凍干粉的氨基酸組成如表4所示，共檢測到18種氨基酸，含量最多的氨基酸按順序依次為谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和天冬氨酸(Asp)，而Glu占氨基酸總量的14.24%(質量分數)，必需氨基酸占氨基酸總量的32.32%(質量分數)。這與ROBERT等[11]的研究結果一致，通過Protamex酶解羅非魚副產物制備抗菌肽，得到Glu、Gly和Asp含量最高的酶解產物，并發現其對魯氏耶爾森氏菌等具有抗菌活性。抗菌多肽鏈中脯氨酸(Pro)和Gly的富集對其生物活性發揮著重要作用[26]。本實驗測得羅非魚副產物酶解物中Pro和Gly的總量占氨基酸總量的19.48%(質量分數)，含量較高，這可能是其具有抑菌活性的原因。并且該酶解物具有均衡的氨基酸組成，所有必需氨基酸的質量分數均高于食肉魚虹鱒魚所定義的氨基酸要求[11]，證實了其在水產飼料中的應用潛力。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上，利用正交實驗得到酸性蛋白酶酶解羅非魚副產物的最佳工藝：酶解時間5 h，酶解溫度40 ℃，pH 2.0，料液比1∶5(g∶mL)，酶添加量0.7%(質量分數)。此條件下制備的酶解液對無乳鏈球菌的抑菌圈直徑為23.38 mm，MIC達到12.5 μg/μL，分子質量有68.08%分布在3 000 Da以下，并具有均衡的氨基酸組成，證明了其營養潛力。本研究對羅非魚副產物酶解肽的抑菌活性進行了初步分析，發現其可能具有治療羅非魚無乳鏈球菌感染的巨大潛力，可被視為有希望的無乳鏈球菌抑制肽來源。為進一步提高其抑菌效果和實用價值，還需對其進行分離純化、質譜鑒定、作用機理、廣譜抗菌性和生物體內實驗等深入探究，為后續預防和治療水產養殖中細菌感染藥物的開發、在食品工業中用作抗菌肽的天然食品成分以及畜牧業飼料加工中的應用提供理論支持。