桂花與石楠葉片中瞬時表達體系的建立試驗初報

閔思源 陳柏楠 陳康 楊妍 曾祥玲

摘 要 木本植物的穩定遺傳轉化難以建立或所需時間長，而在這些木本植物中建立瞬時遺傳轉化可大大提高基因功能分析的效率。因此，使用根癌農桿菌介導的瞬時侵染技術，以桂花和石楠葉片為材料，以β-葡糖醛酸酶基因（β-glucuronidase，GUS）作為實驗結果檢測的報告基因，建立瞬時表達體系。結果發現，侵染過程中，農桿菌對于桂花和石楠葉片有一定的毒性，可加速葉片衰敗;蔗糖溶液相對于水可減緩葉片衰敗;GUS基因表達的蛋白質可能因為葉片木質化程度太高或葉片脫色后褐化而無法檢測或者沒有表達。本實驗為進一步改進桂花和石楠的瞬時表達實驗體系提供了借鑒。

關鍵詞 桂花;石楠;瞬時表達;遺傳轉化

桂花是我國的十大傳統名花之一，自古享有“獨占三秋壓眾芳”的美譽。隨著大量基因測序工作的完成，我國對于植物基因作用的研究也進入了更加深入的階段。目前，對植物基因功能與作用的研究主要通過轉基因技術、基因敲除、基因沉默等方法。瞬時表達是最近幾十年來發展的一種高速、高效率的檢測蛋白質表達的辦法，隨著相關研究不斷深入，逐漸被廣泛應用到生物科學各方面的發展研究中。植物基因瞬時表達體系的構建為簡潔、快速研究啟動子活性、基因功能和蛋白質定位等開辟了新的途徑[1-3]。園林木本植物中的瞬時表達是基因功能檢測鑒定的有效方法，相較于穩定的遺傳轉化系統而言，瞬時表達具有一定優勢：1）簡潔高效，可操作性強，不需要經過漫長的組織培養過程，能夠一周甚至幾天內轉化基因;2）基因表達的水平較高;3）安全，因為被轉移的基因沒有被整合到基因組中，不會產生能夠遺傳的下一代，不會有基因飄移的生態風險[4-5]。基因瞬時表達技術是在比較短的時間跨度范圍內將植物需要表達的目的基因轉化到靶細胞中，在靶細胞內建立一種暫時能夠高效表達的體系。其中，β-葡糖醛酸酶基因（β-glucuronidase，GUS）被作為報告檢測基因廣泛應用在瞬時表達系統中[6]。

農桿菌介導的瞬時表達方法已經發展成為一種高速、高效率的基因表達與分析的辦法。它的原理是將目的基因嫁接在表達載體上，然后轉化到根癌農桿菌中，采用農桿菌侵染的方法，以GUS和GFP作為報告基因，建立瞬時轉化方法[7-8]。農桿菌菌液的濃度、菌液培養環境、細胞的基因型和葉片根莖的生理狀態對基因瞬時表達都會有影響，實驗過程中的溫度、光照以及農桿菌菌液的類型也是影響瞬時表達的因素[9-10]。本研究擬在桂花和石楠葉片中探索瞬時表達體系，以期為桂花、石楠以及更多園林木本植物基因功能鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗采用園林木本植物四季桂和石楠葉片，于2020年4月底采集當年生枝條上的成熟葉片。載體采用攜帶35S啟動子和GUS報告基因的pCAMBIA1391載體。

1.2 實驗方法

1.2.1 農桿菌菌液的制備

把準備好的LB培養基分別加在兩個消毒的錐形瓶中各5 mL，再用1 000 μL的移液槍各加入1 mL的硫酸卡那霉素（kana）抗生素，挑選培養基平板上單個含有β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的菌落和單個含有P19基因的菌落到5 mL LB溶液的錐形瓶中，培養基用完必須密封好并放在4 ℃的條件下保存。將菌液放在恒溫振蕩器的搖床中在200 r·min-1、28 ℃條件下避光12 h左右過夜。待菌液渾濁，用500 mL的LB培養基加入硫酸卡那霉素溶液放入恒溫振蕩器的搖床中進行擴大培養，同樣在200 r·min-1、28 ℃避光條件下培養12 h過夜。

1.2.2 瞬時侵染

將培養的菌液離心收集，然后用侵染液（10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1 MES、150 mmol·L-1 AS）懸浮菌液，調整OD600至0.5～1.0，室溫靜置2～3 h，用于侵染。將四季桂和石楠的葉片分別用8 mm、10 mm的打孔器各打出200個不帶葉主脈的圓形小片。把打好的圓形小葉片放入準備好的菌液侵染液，然后放入真空箱，在0.7 MPa真空條件下保持5 min。把侵染的石楠和四季桂分成16組培養，分別用去離子水和5%蔗糖溶液培養，2 d后進行染色，實驗各處理編號如表1所示。

1表示只用侵染液，無農桿菌;2表示用侵染液、P19;3表示用侵染液、GUS;4表示用侵染液和P19∶GUS=1∶1，下同1.2.3 GUS檢測吸取1 mL X-gluc溶解液加入到X-gluc管中，徹底混勻至完全溶解，即配成X-gluc溶液。將處理好的葉片放入5 mL的離心管中，用配制好的GUS染色工作液完全覆蓋材料，用錫箔紙包好后放入恒溫振蕩器的搖床中在100 r·min-1、37 ℃的條件下培養24 h。將侵染培養的葉片轉入無水乙醇中，放入恒溫振蕩器的搖床中24 h過夜，再用75%的乙醇溶液放在搖床中繼續脫水24 h然后用肉眼和顯微鏡進行觀察。

2 結果與分析

2.1 葉片離體瞬時表達結果

通過圖1、圖2和表2的比較可以看到桂花和石楠葉片在相同條件下的對比情況。石楠葉片相較于桂花而言木質化程度低，桂花葉片革質化嚴重。在侵染過程中，石楠相較于四季桂而言，葉片更容易褐化、衰敗。另外，離體葉片的培養液選擇對于葉片的生理活性有一定影響，從圖2可以看出，不同培養條件下，葉片的褐化、衰敗情況不同，農桿菌對于葉片有明顯損害，凡是進行了農桿菌菌液侵染的葉片都比只用侵染液的葉片褐化、衰敗更為嚴重。P19可抑制外源基因被植物內源免疫系統沉默，提高外源基因瞬時表達效率。但圖2對比實驗發現，是否加入P19基因對于葉片的損傷差異不大。

2.2 離體葉片GUS染色分析

對侵染染色后的桂花和石楠葉片進行觀察，如圖3所示，未發現明顯的藍色或者淡藍色斑點或者條紋出現，將16組侵染的葉片在顯微鏡下觀察也沒有發現有藍色斑點或者條紋。未出現藍色斑點可能是因為外源基因無法表達，也可能是因為外源基因表達十分微少，亦或葉片脫色后呈褐色狀態，影響觀察效果。因此，后期需要進一步改進和完善實驗條件，增加處理因素，以明確影響桂花和石楠瞬時表達效果的原因。

3 結論與討論

通過對實驗現象的觀察與分析發現，攜帶有外源基因的農桿菌會降低石楠和桂花葉片的生理活性，使葉片加速衰敗。用去離子水培養侵染過的石楠和桂花葉片會比用蔗糖溶液培養的葉片衰敗更快，說明蔗糖可較好保持立體葉片的生理活性。石楠和桂花葉片在用侵染液侵染后的培養過程中發現，石楠相較于桂花更容易受到農桿菌液的損傷，葉片細胞的衰敗更明顯，而桂花雖然也會受到農桿菌液的影響，但影響相對較小，可能是因為四季桂的葉片革質和木質化程度更高，對于農桿菌液帶來的損害起到了一定的緩沖作用。在進行真空侵染時也發現，桂花葉片更難侵入農桿菌液。含有GUS基因和含有P19基因的農桿菌侵染液都會加速桂花和石楠葉片衰敗。菌液無法用GUS染液染出藍色，只有該質粒轉化到植物細胞之后，GUS基因才能表達。

侵染4 d后的桂花和石楠葉片經過無水乙醇和75%乙醇兩次脫水后無法用肉眼或者在顯微鏡下觀察到明顯的藍色斑點或藍色條紋，原因可能是多方面的：1）GUS基因無法在桂花和石楠葉片中滿足表達條件;2）表達的蛋白質微量，無法用肉眼或者顯微鏡觀察到;3）石楠和四季桂的葉片太厚無法觀察;4）葉片褐化造成的顏色遮蓋，具體原因還需進一步研究。目前，農桿菌介導的瞬時表達方法已經在煙草、擬南芥、萵苣、番茄、草莓、梨等多種植物中得到應用。雖然本研究沒有在直觀上檢測到瞬時表達的GUS蛋白表型，但也為后續其他園林木本植物瞬時表達體系提供了一參考。

參考文獻：

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（責任編輯：劉昀）