EPF單抗聯合順鉑對家畜膀胱腫瘤抑瘤效果的影響

鐘永怡 周泉 蘇立杰 練玉銀 王家驥 陳驍熠

摘要：為觀察早孕因子單克隆杭體（EPF-McAb）聯合順鉑（DDP）對膀胱癌細胞EJ裸鼠移植瘤的抑制作用，常規將EJ細胞接種于裸鼠右側背部皮下，待腫瘤長至直徑約5mm時隨機分為4組，每組5只，即空白對照組、順鉑組、低劑量單杭聯合組和高劑量單杭聯合組。定期測量裸鼠腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。給藥2周后處死裸鼠，剝取腫瘤，稱瘤重，計算抑瘤率。通過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色觀察細胞病理學改變;免疫印跡法檢測早孕因子（EPF）的表達情況。結果表明，順鉑組、低劑量單杭聯合組和高劑量單杭聯合組裸鼠移植瘤生長速度均慢于空白對照組。與順鉑組比較，低劑量單杭聯合組和高劑量單杭聯合組裸鼠末次給藥的移植瘤體積分別為（131.05±8.26）和（97.92±7.35）mm³。低劑量單杭聯合組抑瘤率（35.78%）和高劑量單杭聯合組抑瘤率（53.04%）均高于順鉑組抑瘤率（22.36%），差異均達顯著水平（P<0.05）。與空白對照組比較，單杭聯合組裸鼠EPF蛋白的表達量下降（P<0.05）。表明EPF-McAb聯合順鉑可抑制膀胱癌細胞EJ在裸鼠體內增殖，其機制可能通過抑制EPF的表達發揮作用。

關鍵詞：早孕因子單克隆杭體（EPF-McAb）;順鉑;膀脫腫瘤;家畜

中圖分類號：R739.5 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）09-0133-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.028

一般來說，動物的膀胱腫瘤是比較罕見的，然而在世界的某些地區牛、羊等家畜的膀胱腫瘤卻比較多見[1]。家畜中的膀胱癌是一種分化程度較低、具有高度浸潤轉移能力、預后差的惡性腫瘤[2，3]。大多數患有膀胱腫瘤或者尿道腫瘤的家畜都會出現血尿、尿頻、痛性尿淋漓或排尿困難等癥狀，其他癥狀包括尿失禁、多尿、煩渴和呼吸困難等[4，5]。早孕因子（EPF）是在妊娠早期哺乳動物血清中存在的一種分泌性蛋白，由澳大利亞學者Morton在試驗中發現并命名[6]。EPF不僅是正在分裂的胚胎和腫瘤組織的產物[7-9]，也是正在增殖的細胞的產物，胚胎和腫瘤的生長存活均有賴于EPF。因此，EPF具有免疫抑制活性、生長調節活性和免疫逃逸作用[10-12]。關于早孕因子單克隆抗體（EPF-McAb）聯合順鉑（DDP）在動物體內對膀胱癌抑制作用的研究少見報道，本試驗通過建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型，研究EPF-McAb聯合DDP的抗家畜膀胱腫瘤效應并初步探討其作用機制，為EPF-McAb在家畜膀胱腫瘤治療中的應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、動物及主要材料

人膀胱癌細胞EJ，中國科學院上海細胞庫;6周齡SPF級BALB/c雄性裸鼠，廣州中醫藥大學實驗動物中心[許可證號：SCXK（粵）2013-0034]：順鉑，齊魯制藥有限公司;胎牛血清、DMEM及0.25%胰酶，Gibco公司;細胞裂解液、PMSF，上海碧云天生物技術有限公司;辣根酶標記山羊抗小鼠IgG，北京鼎國生物技術有限責任公司;蘇木素，南京建成生物工程研究所有限公司;ECL發光液，美國millipore公司;β-actin抗體，Abeam公司：倒置顯微鏡，德國Leica公司;凝膠成像分析系統，美國Azure公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和動物飼養 細胞培養于含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中，置于37℃、飽和濕度、5%CO₂孵箱中培養。BALB/c裸鼠飼養于無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）環境中。

1.2.2 動物模型的建立、分組及給藥 無菌環境下取對數生長期的EJ細胞0.25%胰酶消化后，制成密度為5×10⁷個/mL的單細胞懸液，用注射器取0.2mL接種于裸鼠右側背部皮下。7d后可見有移植瘤生長，隨后每天用游標卡尺測量裸鼠移植瘤直徑，待腫瘤長至直徑約5mm后，將20只裸鼠隨機分成4組，即空白對照組（生理鹽水）、順鉑組（2mg/kg DDP）、低劑量單抗聯合組（100μgEPF-McAb和2mg/kgDDP）、高劑量單抗聯合組（300μgEPF-McAb和2mg/kg DDP），每組5只。尾靜脈注射，隔天給藥，共給藥4次。

1.2.3 繪制腫瘤生長曲線 分組后每2d測量腫瘤直徑1次，記錄移植瘤的最大徑（a）和最小徑（b），計算腫瘤體積。腫瘤體積（mm³）=長徑（a）×短徑（b）²×π/6，記錄至試驗結束。根據各組腫瘤體積的平均值繪制腫瘤生長曲線。

1.2.4 計算抑瘤率 最后一次給藥后第10天，頸椎脫臼法處死全部裸鼠，剝離瘤體并稱瘤重，計算腫瘤的抑瘤率。抑瘤率=（1-治療組平均瘤質量/空白組平均瘤質量）×100%。

1.2.5 組織形態學觀察 切取腫瘤后，立即固定于10%中性甲醛溶液中，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，常規包埋蠟塊，切片進行HE染色，光鏡下觀察腫瘤細胞數目、密度及壞死情況。

1.2.6 蛋白印跡試驗 分別收集空白組和試驗組細胞提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，加入loading buffer混合后沸水浴變性，經15%SDS-PAGE電泳后轉膜，5%脫脂牛奶封閉2h，EPF-McAb稀釋度為1：1000，室溫中孵育2h后洗膜，二抗孵育膜1h，再次洗膜后采用ECL在暗室中顯色，X光膠片記錄陽性條帶，掃描后用gel pro 4.0軟件分析陽性條帶灰度值，以EPF與β-actin灰度值的比值為EPF蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析

應用SPSS17.0統計軟件對資料進行處理分析。所有計量資料均符合正態分布，以平均值士標準誤（x±s）表示;計量資料間比較，在確定方差齊性后（P>0.05），采用單因素方差分析（One-way ANO-VA），各組間的多重比較采用Bonferroni法;如果方差不齊（P<0.05）則采用Welch法，組間多重比較采用Dunnett's T3法。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 裸鼠移植瘤體積和腫瘤生長情況

由圖1可見，接種后，各治療組移植瘤均表現為體積增大，呈局部結節狀生長。空白對照組、順鉑組、低劑量單抗聯合組和高劑量單抗聯合組裸鼠腫瘤體積平均分別為（1071.40±116.31）、（831.05±53.24）、（702.13±29.75）和（503.59±47.81）mm³。順鉑組、低劑量單抗聯合組和高劑量單抗聯合組裸鼠的移植瘤生長速度均顯著慢于空白對照組（P<0.05）。

2.2 裸鼠腫瘤質量和抑瘤率

最后一次給藥后第10天處死裸鼠，解剖見腫瘤表面包膜完整，呈結節狀或類圓形，空白對照組、順鉑組、低劑量單抗聯合組和高劑量單抗聯合組裸鼠腫瘤質量分別為（2.102±0.141）、（1.632±0.118）、（1.350±0.071）和（0.987±0.056）g;順鉑組、低劑量單抗聯合組和高劑量單抗聯合組的抑瘤率分別為22.36%、35.78%、53.04%，與空白對照組比較差異均顯著（P<0.05）（表1）。

2.3 HE染色觀察EPF-McAb聯合順鉑對裸鼠皮下移植瘤形態的影響

鏡檢結果可見，空白對照組裸鼠腫瘤細胞間隙較小，分布均勻，但排列紊亂，具有明顯的核異型性、核分裂多、細胞核大、胞質較少等特點。低劑量單抗聯合組及高劑量單抗聯合組與順鉑組相比，病理可見腫瘤細胞大小不均，細胞間隙較大，形態不整，細胞核固縮，核分裂相對較少，可見有少量炎性細胞浸潤，腫瘤細胞壞死明顯，細胞增殖被抑制（圖2）。

2.4 EPF蛋白表達

由圖3可見，空白對照組、順鉑組、低劑量單抗聯合組和高劑量單抗聯合組裸鼠EPF蛋白表達灰度值分別為101.05、75.46、31.37、16.71;順鉑組、低劑量單抗聯合組和高劑量單抗聯合組與空白對照組相比差異均達顯著水平（P<0.05）。

3 小結與討論

家畜中的膀胱腫瘤是一種分化程度較低、具有高度浸潤轉移能力、預后差的惡性腫瘤[2，3]，家畜疾病的防治工作直接影響養殖戶的收入及養殖業的發展水平[13]。研究發現抗EPF-McAb對小鼠體內移植瘤生長有影響[14]，抗EPF-McAb無論在體外或體內均可抑制腫瘤的生長[14]。本試驗通過建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型，尾靜脈給藥后，繪制腫瘤生長曲線，觀察抑瘤效果;通過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eo-sin，HE）染色觀察細胞病理學改變;免疫印跡法檢測EPF蛋白的表達情況，了解EPF-McAb聯合順鉑對裸鼠膀胱腫瘤的抑瘤效果。結果表明，EPF-McAb聯合順鉑可抑制膀胱癌細胞EJ在裸鼠體內增殖，其機制可能通過抑制EPF蛋白的表達發揮作用，為進一步探究家畜膀胱腫瘤的治療奠定了基礎。

張冬云等[9]在肺癌等多種腫瘤或非腫瘤患者的血清中發現，絨癌、膀胱癌、黑色素瘤、惡性葡萄胎4種腫瘤血清和黑色素瘤標本組織液具有t-EPF活性，故猜測EPF-McAb可能對膀胱腫瘤有治療作用。在本試驗中，隨EPF-McAb劑量的增加腫瘤的體積及質量逐漸減小，順鉑組、低劑量單抗聯合組和高劑量單抗聯合組的抑瘤率分別為22.36%、35.78%、53.04%，表明不同濃度的EPF-McAb有顯著抑制腫瘤生長的作用，抑瘤效果較順鉑組更為顯著，且隨著EPF-McAb劑量的增加，對腫瘤的抑制作用逐漸增強，抑制作用與濃度呈明顯的相關性，這與Quinn等[15]的試驗結果一致，表明EPF-McAb對膀胱癌有很好的治療作用。

已有較多報道顯示單抗聯合臨床藥物對裸鼠移植瘤的生長有抑制作用。張皓等[16]提出，曲妥珠單抗聯合吉西他濱可以有效抑制裸鼠移植瘤生長，其機制可能與下調Cox-2蛋白表達有關;此外，梁亮等[17]發現，西妥昔單抗聯合伊馬替尼可以下調ATP7A、p-Akt、p-mTOR蛋白表達，同時明顯降低結腸癌大鼠血清VEGF含量，進而影響結腸癌組織中的能量合成，抑制腫瘤細胞的增殖;祝保艷等[18]則表示卡博替尼聯合PD-L1單抗對黑色素瘤小鼠移植瘤有抑制作用，這種協同抗腫瘤作用機制可能是通過促進 B16-F10細胞凋亡及抑制AKT/mTOR通路所致。而在本研究中，EPF-McAb聯合順鉑可以明顯抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生長，與上述研究結果一致。

有研究顯示，EPF-McAb使腫瘤細胞體外生長受到限制，可能是由于EPF-McAb干擾了維持腫瘤細胞增殖活性階段的機制[14]。EPF具有免疫抑制作用，主要抑制淋巴細胞功能，而且EPF與腫瘤生長有關[15，19]，利用EPF-McAb結合EPF蛋白，可能減輕EPF對免疫系統的抑制作用，從而抑制EJ細胞的增殖。故單抗聯合藥物對腫瘤的治療具有一定理論和試驗依據。對于家畜來說，若能科學地使用和掌握藥物，就能有效地治療家畜養殖中遇到的相關疾病，有助于家畜的健康成長，并提升其經濟效益[20]。

綜上所述，本研究結果表明EPF-McAb聯合順鉑可抑制膀胱癌細胞EJ在裸鼠體內增殖，其機制可能通過抑制EPF蛋白的表達發揮作用。本試驗結果為EPF-McAb治療家畜膀胱腫瘤提供了一定的理論依據。

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收稿日期：2019-05-30

基金項目：廣東省科技計劃重點項目（2008A030201022）

作者簡介：鐘永怡（1993-），女，廣東清遠人，在讀碩士研究生，研究方向為公共衛生與預防醫學，（電話）13678920392（電子信箱）zhongyon-gyi1993@163.com;通信作者，王家驥（1955-），男，廣東廣州人，教授，碩士生導師，主要從事全科醫學研究，（電話）13926179883（電子信箱）wjiaji@163.com;陳驍熠（1965-），女，廣東廣州人，教授，碩士生導師，主要從事食品與營養衛生研究，（電話）18620586562（電子信箱）wwchenxyl@163.com。