高產葉黃素小球藻(Chlorella sorokiniana) FZU60高鹽度適應性馴化及表征

馬瑞娟，唐珠珍，趙旭蕊，謝友坪*，陳劍鋒

1(海洋生物高值高質化利用技術創新服務平臺(福州大學)，福建 福州， 350108)2(福建省海產品廢棄物綜合利用工程技術研究中心(福州大學)，福建 福州， 350108)3(福州市海產品高值化利用行業技術創新中心(福州大學)，福建 福州， 350108)4(廈門大學 化學化工學院，福建 廈門， 361005)

葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素，存在于高等植物和其他光自養生物(如藻類)中[1]。由于具有抗氧化、抗炎和著色等特性，葉黃素被廣泛用作食品添加劑、飼料添加劑或功能性營養品等，其市場價值約為3億美元[2]。市售的葉黃素主要來源于萬壽菊，但是以萬壽菊生產葉黃素存在生長速度慢、勞動力成本高和占用大量耕地資源等問題[3]。利用微藻生產葉黃素具有生長速度快、葉黃素含量高、不占用耕地、可以全年收獲等優點[3]。但其生產成本相對較高，如生產1 kg 柵藻(Scenedesmusalmeriensis)藻粉的成本約為69歐元[4]，導致商業化應用受限。室外開放式培養系統(如開放池和跑道池)由于生產成本較低而被廣泛用于微藻基產品的商業化生產，但是這種培養系統需要使用大量的水資源，據報道，生產1 kg藻粉和1 kg葉黃素分別需要消耗0.19～0.77 t和38～154 t水[3]。由于淡水資源相對匱乏，如能采用海水培養微藻，可在一定程度上改善微藻大規模生產的經濟可行性[5]。

進化育種技術常被用于選育有價值的微藻品系。在進化育種中，通過設定選擇性條件進行生物的長期適應培養，以通過自然突變來改善細胞表型[6]。KATO等[7]研究發現，經過長期的高鹽度適應性馴化，衣藻的耐鹽株可在70 g/L鹽度條件正常生長。目前，已報道生產葉黃素的藻種主要有Chlorellaprotothecoides、S.almeriensis、Muriellopsissp.、Chlorococcumcitriforme、Neospongiococcusgelatinosum等，這些藻株的葉黃素質量分數一般為3～7 mg/g，葉黃素產率可達1～10 mg/(L·d)[8]。本課題組前期篩選獲得了1株小球藻(Chlorellasorokiniana) FZU60，其葉黃素質量分數及產率可分別高達9.57 mg/g和11.57 mg/(L·d)[9]。為提高該藻株的耐鹽性，本研究對其進行了高鹽度適應性馴化培養，分析了馴化過程其細胞生長及細胞組成的變化，并進一步對比了耐鹽株和原始株的葉黃素生產情況，旨在為利用海水進行微藻葉黃素生產及降低生產成本提供合適的藻種來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻(Chlorellasorokiniana) FZU60，由福建省海產品廢棄物綜合利用工程技術研究中心保存。

三氟化硼/甲醇溶液為分析純，CNW公司；正己烷、甲醇均為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；乙酸銨、37種脂肪酸甲酯混標、二十碳酸甲酯標準品均為色譜純，Sigma-Aldrich公司；丁基羥基甲苯、甲基叔丁基醚均為色譜純，Acros Organics公司；三乙胺為色譜純，Fisher Chemical公司；葉黃素、紫黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素的標準品均為色譜純，Chromadex公司；丙酮、無水乙醚、無水Na2SO4、乙醇、苯酚、H2SO4、HCl、葡萄糖、木糖以及BG11培養基[10]成分均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；海鹽為分析純，Sigma-Aldrich公司；PierceTMBCA蛋白定量分析試劑盒，Thermo公司。

1.2 儀器與設備

TGL-20bR高速冷凍離心機、LXJ-2B低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；ST3100F pH計，OHAUS奧豪斯儀器常州有限公司；AB104N電子天平，Sartorius公司；RCT-B-S025加熱磁力攪拌器，德國IKA公司；DW-HL340超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限公司；SP-756P紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；PGX-450D智能光照培養箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；移液槍，德國Eppendorf公司；FD-2真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；Ci-S顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；GC-2014C氣相色譜儀、LC-16高效液相色譜儀，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小球藻高鹽度適應性馴化

從生長良好的小球藻平板中挑取藻泥，按質量濃度35～50 mg/L的初始接種量轉接于40 g/L鹽度的BG11培養基中，調節pH值為7.5。控制培養條件為：溫度30 ℃，光照強度150 μmol/(m2·s)，攪拌速率500 r/min，并以0.15 vvm的通氣速率連續供應2.5%(體積分數)CO2。每隔5 d重新轉接1次，待藻細胞在40 g/L鹽度生長穩定后轉接于50 g/L鹽度的BG11培養基中，直至藻細胞在50 g/L鹽度生長穩定。每隔一定時間測定藻液的生物量、pH和NaNO3質量濃度，并在顯微鏡下觀察藻細胞形態。在每次轉接前離心收集藻體，于-20 ℃保存，用于測定色素、蛋白、碳水化合物和油脂的質量分數。

1.3.2 耐鹽株和原始株在30 g/L鹽度下的培養表征

將原始藻株接種于不含海鹽的BG11培養基中，耐鹽藻株接種于50 g/L鹽度的BG11培養基中，二者均培養至對數生長期后按質量濃度60～70 mg/L的初始接種量分別轉接至30 g/L鹽度的BG11培養基中培養，同時控制培養條件為：溫度33 ℃，光照強度600 μmol/(m2·s)，攪拌速度500 r/min，并以0.15 vvm的通氣速率連續供應2.5%CO2。每隔一定時間測定藻液的生物量、pH和硝酸鹽質量濃度。待硝酸鹽消耗90%時，離心收集藻體，用于測定葉黃素質量分數。

1.3.3 藻體生物量的測定

采用分光光度計測定藻液在682 nm波長下的吸光值，根據標準曲線計算生物量質量濃度。藻株FZU60在40 g/L鹽度下馴化培養1、3、6、9、12批次時其生物量質量濃度標準曲線分別為y=0.332 8x-0.001 3(R2=0.999 8)、y=0.312 8x-0.000 8(R2=0.999 9)、y=0.333 7x-0.000 6(R2=0.999 9)、y=0.330 1x-0.001 8(R2=0.999 8)、y=0.321x-0.000 9(R2=0.999 9)；在50 g/L鹽度下馴化培養1、2、6、9、13批次時其生物量質量濃度標準曲線分別為y=0.359 6x-0.000 3(R2=1)、y=0.376 5x+0.000 7(R2=0.999 8)、y=0.390 6x-0.000 8(R2=0.999 9)、y=0.360 8x-0.002 6(R2=0.999 7)、y=0.370 6x-0.002 5(R2=0.999 7)。其中，y為生物量質量濃度(g/L)，x為OD682 nm值。根據XIE等[11]的方法計算生物量產率和比生長速率。

1.3.4 NaNO3質量濃度的測定

由于NO3-在220 nm波長下具有最大的吸光值，根據XIE等[12]報道的紫外分光光度計法測定藻液的NaNO3質量濃度。NaNO3質量濃度(y,mg/L)與OD220 nm值(x)之間的對應關系為：y=22.63x-0.035 9(R2=0.999 8)。

1.3.5 藻體色素含量的測定

采用丙酮提取法[13-14]測定小球藻的葉綠素含量。采用CHEN等[15]報道的方法萃取小球藻的類胡蘿卜素，然后采用TAYLOR等[16]報道的高效液相色譜法測定各類胡蘿卜素組分。

1.3.6 蛋白質含量的測定

采用 PiercTEBCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白質含量。

1.3.7 氨基酸組成測定和必需氨基酸指數(essential amino acid index,EAAI)的計算

氨基酸組成的測定參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。按公式(1)計算EAAI[17]：

(1)

式中：aan，樣品中必需氨基酸質量占總蛋白質量的比例；AAn，FAO/WHO參考標準中必需氨基酸質量占總蛋白質量的比例[18]。

1.3.8 藻體碳水化合物含量的測定

采用H2SO4-苯酚法[13,19]測定小球藻FZU60細胞中的碳水化合物含量。碳水化合物含量(y,mg/L)與OD490 nm值(x)之間的對應關系為：y=83.365x-0.340 1(R2=0.999)。

1.3.9 藻體油脂含量及其組成的測定

采用直接轉酯化方法[13]測定小球藻FZU60中的油脂含量及組成。

2 結果與分析

2.1 鹽度適應性馴化過程中小球藻的生長情況變化

如圖1所示，在40 g/L鹽度下經過連續12批次的轉接馴化培養，小球藻的生物量質量濃度可從1.00 g/L提高至2.31 g/L。且繼續在50 g/L鹽度下經過13批次的馴化培養，藻細胞的質量濃度可穩定在2.11 g/L(圖2)。該結果說明在馴化過程中，藻細胞逐漸適應了高鹽度環境。鹽度主要以滲透脅迫、離子(鹽)脅迫或改變細胞離子比率3種方式影響浮游植物[20-21]。藻細胞可通過滲透作用將Na+隔離在液泡中，以保持在高鹽度下的膨脹壓力，從而適應一定程度的鹽度脅迫[22]。

圖1 40 g/L鹽度下藻株FZU60適應性馴化過程的生物量變化曲線Fig.1 Biomass concentration curve of strain FZU60 duringadaptive domestication under 40 g/L salinity

圖2 50 g/L鹽度下藻株FZU60適應性馴化過程的生物量變化曲線Fig.2 Biomass concentration curve of strain FZU60during adaptive domestication under 50 g/L salinity

由圖3可知，與原始藻株相比，耐鹽株的細胞體積變大，藻體顏色加深。有研究發現，一些綠藻(如萊茵衣藻和雨生紅球藻)可通過形成聚集的肥大細胞以應對外界的脅迫條件[23-24]。因此，小球藻FZU60可能通過增大細胞體積來應對外界的高鹽環境。

a-原始株；b-耐鹽株圖3 FZU60原始藻株與耐鹽藻株的細胞形態Fig.3 Cellular morphology of wild and salt-tolerantstrains of FZU60

2.2 鹽度適應性馴化過程中小球藻FZU60的類胡蘿卜素組成變化

如圖4所示，經過40 g/L鹽度的馴化培養，藻細胞的總類胡蘿卜素質量分數從8.39 mg/g提高至12.08 mg/g；轉移至50 g/L鹽度條件馴化時，總類胡蘿卜素質量分數則呈現先降低后升高趨勢。在鹽度適應性馴化前期藻細胞的總類胡蘿卜素質量分數較低，這可能是由于在高鹽條件下光合系統I的捕光復合物被活性氧破壞[25]。而隨著馴化次數的增加，藻細胞逐漸適應高鹽環境，使得總類胡蘿卜素質量分數逐漸提高。小球藻FZU60的類胡蘿卜素組成主要包括葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、紫黃素、新黃素。在整個鹽度適應性馴化過程中，葉黃素可維持在總類胡蘿卜素的61%～67%(質量分數)。

4-1、4-3、4-6、4-9、4-12表示40 g/L鹽度條件下馴化1、3、6、9、12次；5-1、5-2、5-6、5-9、5-13表示50 g/L鹽度條件下馴化1、2、6、9、13次(下同)圖4 鹽度適應性馴化過程中藻株FZU60的類胡蘿卜素含量及組成變化Fig.4 Ccarotenoid content and composition of strain FZU60during salinity adaptive domestication

2.3 鹽度適應性馴化過程中小球藻FZU60的氨基酸組成變化

如圖5所示，經過40 g/L鹽度的適應性馴化培養，藻細胞的必需氨基酸占總氨基酸的含量略微增加，從32.79%提高至36.54%；而轉移至50 g/L鹽度條件下時，其必需氨基酸占總氨基酸的含量在33.33%～34.71%波動。

圖5 鹽度適應性馴化過程中藻株FZU60的氨基酸組成和EAAI變化Fig.5 Amino acid composition and EAAI of strain FZU60during salinity adaptive domestication

此外，在40 g/L鹽度馴化條件下，EAAI值呈現上升趨勢，從1.30提高至1.51，但轉移至50 g/L鹽度馴化后，EAAI則呈現下降趨勢，最終下降至1.34左右。這可能與馴化過程中藻細胞所需的蛋白質種類密切相關。EAAI>1表示蛋白品質優良，可用于人類食品[17,26]。因此，在鹽度適應性馴化過程中小球藻FZU60的氨基酸組成可保持優良品質。

2.4 鹽度適應性馴化過程中小球藻FZU60的脂肪酸組成變化

如圖6所示，藻細胞中肉豆蔻酸(C14∶0)的含量較低，僅占總脂肪酸的1%～2%，而棕櫚酸(C16∶0)和亞油酸(C18∶2)的含量最高，二者質量分數可占總脂肪酸的53%～58%。在鹽度脅迫條件下脂肪酸含量及組成的變化可能是為了維持膜的流動性以防止細胞被破壞[27]。在鹽度適應性馴化過程中，飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)比例總體呈現先下降后上升趨勢，最終由39.69%提高至40.6%；單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)比例呈現上升趨勢，從20.69%提高至22.35%；多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)比例呈現下降的趨勢，從39.62%下降至37.05%。這與XU等[28]在鹽藻Dunallielasp.中的研究結果相一致。

圖6 鹽度適應性馴化過程中藻株FZU60的脂肪酸組分變化Fig.6 Fatty acid composition of strain FZU60 duringsalinity adaptive domestication

2.5 鹽度適應性馴化過程中小球藻FZU60的細胞組分變化

如圖7所示，小球藻FZU60的細胞組成主要包含蛋白質、脂肪酸、碳水化合物和色素(葉綠素和類胡蘿卜素)，其中前3者占細胞組成的81%～92%。在鹽度馴化過程中，蛋白質質量分數從37.60%提高至46.48%；油脂質量分數從9.80%提高至12.59%；碳水化合物質量分數從34.05%降低至26.23%；色素質量分數變化不大。以上結果表明,高鹽度可促進藻細胞內蛋白質和脂質的積累，但不利于碳水化合物積累。類似地，有研究表明高鹽條件下藻細胞的碳水化合物合成會受到抑制[29]，而油脂合成的效率則會提高[22]。這可能是由于鹽度脅迫可激活相關酶的活性，以分解碳水化合物用于合成能量更高的油脂，從而使得細胞能夠承受滲透壓力的變化。例如，在鹽脅迫下嗜鹽微藻(Dunaliellasalina)胞內淀粉(碳水化合物)會被代謝轉移至三酰甘油酯(油脂)的生物合成中[30]。

圖7 鹽度適應性馴化過程中藻株FZU60的細胞組分變化Fig.7 Cell composition of strain FZU60 during salinityadaptive domestication

2.6 30 g/L鹽度下耐鹽株和原始株的細胞生長及葉黃素積累情況

海水鹽度一般在30～35 g/L，若微藻能在30 g/L鹽度下生長，則可以使用海水進行培養，從而達到節約淡水資源并降低微藻培養成本的目的[31]。如圖8-a所示，在30 g/L鹽度條件下培養4 d的過程中，耐鹽株的生物量質量濃度始終高于原始株，且耐鹽株的氮源消耗速度也更快(如圖8-b)。

a-細胞生長；b-氮源消耗圖8 30 g/L鹽度下FZU60原始株和耐鹽株的細胞生長及氮源消耗情況Fig.8 Cell growth and nitrogen source consumptionof wild and salt-tolerant strains of FZU60 at 30 g/L salinity

有研究報道，當培養基中氮源即將耗盡時(耗完90%氮源)，藻細胞的葉黃素質量分數可達最高，因此一般在此時間點收集藻細胞用于葉黃素提取[32]。如圖8-b所示，原始株和耐鹽株分別在培養2.31和2.02 d時耗完90%氮源，此時兩者的葉黃素質量分數無顯著性差異，分別為(7.26±0.13)和(7.31±0.23) mg/g(表1)。但由于耐鹽株的生物量產率明顯高于原始株，使得其葉黃素產率及產量均顯著高于原始株(表1)。因此綜上可知，在30 g/L鹽度下耐鹽株具有更高的葉黃素生產能力。

表1 30 g/L鹽度下FZU60原始株和耐鹽株的細胞生長及葉黃素生產情況對比Table 1 Comparison of cell growth and lutein productionof wild and salt-tolerant strains of FZU60 at 30 g/L salinity

3 結論

本研究采用長期的高鹽度適應性馴化方法，獲得了可在50 g/L鹽度下正常生長的耐鹽小球藻藻株。與原始藻株相比，耐鹽株的細胞體積增大，藻體顏色加深。經過高鹽度適應性馴化培養，耐鹽株的油脂和蛋白質質量分數均有所提高，色素質量分數無顯著變化，但碳水化合物質量分數有所降低。在30 g/L鹽度下，耐鹽藻株具有更高的生物量產率和葉黃素產率，因此可用于海水培養生產葉黃素的實際應用中。但值得注意的是，本研究采用海鹽來配制海水，若直接采用天然海水進行培養，可能會由于不同海域的海水其鹽離子組成及配比存在差異，從而會對藻體生長和葉黃素合成產生一定影響，因此在實際應用中需注意海水的離子組成及配比。