低氧與腫瘤治療

金沉

摘 要 低氧是實體瘤的普遍現象，對腫瘤的增殖、凋亡、血管生成、浸潤轉移、能量代謝及放化療抵抗性都具有重要的作用。本文回顧了兩類針對低氧腫瘤的藥物研發策略：作用于低氧誘導因子（hypoxia-inducible factors， HIFs）及其相關信號通路的分子靶向藥物，以及靶向于腫瘤低氧微環境的低氧激活前藥，分別列舉了各個藥物的設計思路和作用機制，對各種策略所面臨的挑戰與機遇進行了探討。

關鍵詞 低氧 低氧誘導因子 低氧激活前藥

中圖分類號：R979.19 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）15-0097-05

Hypoxia and antitumor therapy

JIN Chen*

[Xingliu （Shanghai） Pharmaceutical Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China]

ABSTRACT Hypoxia is a common phenomenon of solid tumors and plays an important role in tumor proliferation， angiogenesis， invasion， metastasis， energy metabolism， resistance to chemotherapy and radiotherapy. In this paper， two approaches for targeting hypoxia in cancer therapy are reviewed. One is molecular targeted agents targeting HIFs and relative signal pathway and the other is hypoxia-activated prodrugs targeting tumor hypoxic microenvironment. Several example compounds with their design and mechanism are listed and the particular challenges and opportunities for each strategy are also discussed.

KEY WORDS hypoxia； HIF； hypoxia-activated prodrug

氧氣是影響細胞生存的重要分子，線粒體在氧氣存在的條件下，通過呼吸作用產生能量，為細胞的生存提供能量基礎。2019年諾貝爾生理學或醫學獎，授予三位科學家William G. Kaelin Jr、 Sir Peter J. Ratcliffe和Gregg L. Semenza，以表彰他們在“細胞感知和適應氧氣供給機制”方面的突出貢獻[1]。

早在1955年，Thomlinson Gray觀測到在距離血管180 mm的腫瘤中心區域出現壞死的現象，這個距離剛好超出了血管中氧氣滲透的范圍。研究認為，腫瘤不受控制的快速增殖，使中心區域愈發遠離血管，造成氧氣和營養物質不能輸送到該區域，因而出現了壞死的現象[2]。這是人類首次對腫瘤低氧現象進行的觀測與研究。盡管腫瘤具有持續誘發促進血管生成的能力，但是腫瘤組織中的新生血管形態異常，微血管網對于氧氣和營養物質的運輸相對低效，高度增殖的腫瘤細胞的耗氧量，超出了微血管網的供氧量，從而使得遠離血管的腫瘤中心區域形成低氧和壞死的現象。越來越多的研究證明，低氧對腫瘤的增殖、凋亡、血管生成、浸潤轉移、能量代謝及放化療抵抗性都具有重要的作用[3-8]。

低氧腫瘤的治療策略，目前主要包含兩個方向：一是作用于HIFs及其相關信號通路的分子靶向藥物[9-10]，二是靶向于腫瘤低氧微環境的低氧激活前藥[11-13]。

1 作用于HIFs及其相關信號通路的分子靶向藥物

2019年獲獎的三位科學家闡明了細胞在分子水平上感受氧氣含量的基本原理，揭示了一個重要的信號機制，即低氧誘導因子HIF（hypoxia-inducible factor）。

細胞應對低氧環境而產生的生理變化，主要由低氧誘導因子HIF進行調節。低氧誘導因子能夠調節多個基因的表達，驅動腫瘤細胞在低氧環境中的適應和生存。低氧誘導因子是應對低氧環境的轉錄因子，是由α亞基（HIF-1α，HIF-2α或HIF-3α）和β亞基（HIF-1β）組成的二聚體蛋白復合物。HIF-α的蛋白家族中，HIF-1α表達最為廣泛，對氧氣敏感；HIF-2α在內皮細胞中首次被檢測到，只在少量組織中表達。對于HIF-3α，目前的研究尚不充分。在氧氣存在的條件下，HIF-1α的脯氨酸殘基經過脯氨酰羥化酶（PHD）的羥基化作用后，被蛋白酶體降解。而在低氧條件下，對氧氣敏感的脯氨酰羥化酶活性降低，HIF-1α的羥基化過程不能進行，因降解被抑制而累積，進而從細胞質轉移進入細胞核內，并與HIF-1β組成HIF二聚體。轉錄因子HIF能夠識別并結合靶標基因的一段堿基序列G/ACGTG，即低氧反應元件（hypoxia response elements， HREs），由此開啟相關靶標基因的轉錄過程。這其中包括影響血管生成、糖脂代謝、細胞生長、凋亡、轉移等各方面的調節基因[14-15]。

HIF-1α和HIF-2α受到氧氣敏感型脯氨酰羥化酶的調節作用，從而引起各種生理功能方面的調節，以應對氧氣環境的變化。HIF-1α在多種腫瘤細胞中的高表達，被認為與低氧有著密切的關系。靶向于HIF-1α及其下游相關蛋白，成為低氧腫瘤治療的一個研究方向。HIF-1α下游相關蛋白作用機制明確，如與血管生成相關的血管內皮生成因子（VEGF），與代謝相關的葡萄糖轉運體1（GLUT1），與酸堿平衡相關的碳酸酐酶Ⅸ（CA Ⅸ），與細胞生長相關的胰島素生長因子1（IGF1），與轉移相關的賴氨酰氧化酶（LOX），這些都作為分子靶向藥物開發的重要靶點[16]。

以mTOR（mammalian target of rapamycin）為中心的PI3K/AKT/mTOR信號通路是細胞能量代謝的重要通路。作為HIF-1α上游信號通路的關鍵蛋白，mTOR通過多種作用途徑，影響和調節HIF-1α及其下游基因的表達。mTOR抑制劑在低氧腫瘤的治療中受到廣泛研究，其中，雷帕霉素類化合物表現出明顯的抗腫瘤效果[17-18]。

HIF-1α是受低氧調節的關鍵細胞因子，然而，以HIF-1α為直接作用靶點的分子靶向藥物則相對較少，其原因在于，目前的臨床實驗結果表明，HIF-1α的抑制與抗腫瘤活性之間沒有明顯的關聯。此外，一些HIF-1α的選擇性抑制劑，也并未表現出其對低氧腫瘤細胞的選擇性殺傷。HIF-1α的作用機制與抗腫瘤效果之間的關系尚未被完全闡明，靶向于HIF-1α的研究策略仍具有相當大的挑戰。

2 低氧激活前藥

低氧激活前藥，是利用腫瘤低氧這一特殊的環境，來設計在正常組織中無活性或活性很低，在低氧環境中能夠被激活釋放出活性藥物，從而選擇性殺傷低氧腫瘤細胞。通常，低氧激活前藥是利用低氧腫瘤細胞中高表達的還原性酶還原釋放藥物。

腫瘤組織中的還原酶是低氧激活前藥活化的關鍵因素。還原酶的主要種類有：心肌黃酶（DT-diaphorase）、醌還原酶（quinone reductase）、細胞色素P450還原酶（cytochrome P450 reductase）、硝基還原酶（nitroreductase）等。大多數酶對氧氣敏感，以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）作為氫供體，參與到前藥的還原過程中。

不同的化學結構，其靶向的還原酶種類各不相同。目前，已經證明有四種化學基團能夠在低氧條件下被還原酶降解，它們分別是：過度金屬絡合物，醌類化合物，氮氧化合物（脂肪族氮氧化合物、芳香族氮氧化合物），硝基類化合物（硝基苯類化合物、硝基咪唑類化合物）。這四種結構類型為低氧激活前藥的設計提供了結構基礎[6]。

2.1 過渡金屬絡合物

過度金屬絡合物是利用不同價態的金屬，其絡合物穩定性不同的原理設計的。其中，鈷是最為常用的金屬元素（圖1）。三價鈷的氮芥絡合物能穩定性強，在三價鈷原子的影響下，氮芥上氮原子的電子云密度降低，細胞毒性顯著低于氮芥單體。當絡合物進入低氧腫瘤組織，在還原酶作用下，三價鈷原子被還原為二價鈷原子，導致絡合物不穩定，釋放出細胞毒藥物氮芥，從而對低氧腫瘤細胞造成殺傷[19]。然而，過渡金屬價態之間轉化的可逆性仍沒有解決，該類化合物作為低氧激活前藥的應用仍處于探索階段。

2.2 醌類化合物

醌類化合物的發現與應用最早可以追溯到20世紀60年代絲裂霉素C的發現。EO9作為絲裂霉素C的衍生物，是目前研究較多的代表性藥物。EO9的作用機制包括單電子和雙電子的還原過程，進而產生具有DNA損傷性的分子，這一過程在有氧或低氧的條件下都可以進行。雙電子還原酶，包括醌還原酶和心肌黃酶，在藥物降解過程中起到重要作用，直接決定了藥物是靶向有氧細胞還是低氧細胞。所以，只有在含有較少雙電子還原酶的細胞株上，EO9才是具有選擇性的低氧激活前藥。在缺少雙電子還原酶的條件下，EO9被單電子還原酶還原，如細胞色素P450還原酶，生成半醌自由基中間體，這一過程是可逆的。半醌自由基中間體在低氧條件下繼續被還原，生成具有DNA損傷性的苯二酚類化合物（圖2）。然而，EO9在臨床Ⅰ/Ⅱ期實驗中對多種腫瘤無效。研究認為是由于藥物無法有效輸送到腫瘤部位[20]。

2.3 氮氧類化合物

氮氧鍵化合物作為低氧活化基團，引起了研究人員的注意。Brown[21]發現，芳香族氮氧化合物替拉扎明（TPZ）對低氧腫瘤細胞有50～200倍的選擇性。這類化合物能夠經過單電子還原生成具有DNA損傷性的自由基。隨后，Wilson[22]發現脂肪族氮氧化合物也具有類似的性質。脂肪族氮氧鍵通過雙電子還原形成叔胺，該過程能夠受到氧氣的抑制，因而該過程對氧氣敏感，具有低氧選擇性。該類代表化合物有AQ4N。

作為芳香族氮氧化合物的代表，TPZ經單電子還原酶（如細胞色素P450還原酶）的作用，可逆地形成自由基中間體，在低氧的條件下，繼續還原生成具有DNA損傷性的羥基自由基和苯并三嗪自由基。TPZ也可以被雙電子還原酶（如醌還原酶）還原，但代謝產物不具有細胞毒性（圖3）。這樣特殊的性質使得TPZ在多個細胞株上表現出了良好的低氧選擇性。TPZ經歷了廣泛的臨床實驗研究，然而，TPZ水溶性差，在體內代謝速率快，穿透性差，不能有效達到低氧區域，這些缺陷最終限制了其在臨床上的應用。

脂肪類氮氧化物AQ4N能夠被雙電子還原酶（如細胞色素P450同功酶和一氧化氮合成酶）還原，由于氧氣能夠競爭性與這兩種酶結合，對AQ4N的還原造成抑制，因而AQ4N具有低氧選擇性（圖4）。經還原后生成的AQ4對DNA有著很強的非共價結合能力，并且能夠同時抑制拓撲異構酶Ⅱ，進而抑制細胞的增殖。臨床研究發現，AQ4N的主要問題在于安全性不足。

2.4 硝基苯類化合物

硝基苯類化合物是最早被驗證具有低氧選擇性，并應用于低氧激活前藥的開發。PR-104是硝基苯類化合物的代表藥物，它是一種水溶性磷酸酯的雙重前藥。PR-104在體內能夠迅速水解形成相應的醇PR-104A，PR-104A是具有低氧選擇性的化合物，硝基經過單電子或雙電子還原生成羥氨（PR-104H）和胺（PR-104M），而PR-104H和PR-104M能與DNA發生交聯作用發揮細胞毒性。PR-104A能夠被多種氧化還原酶代謝，在有氧和低氧條件下均能降解（圖5）。PR-104在動物實驗中證明具有顯著的活性，可抑制腫瘤的生長、減少腫瘤細胞對組織的滲透、延長小鼠的生存期。在肝癌異種移植模型中，PR-104能夠抑制腫瘤的生長，并且與索拉非尼的聯合治療，效果更為顯著。然而，在Ⅰ期臨床實驗中，PR-104對實體瘤的抑制效果較弱，且有一定的骨髓抑制和中性粒細胞減少作用[23]。

2.5 硝基咪唑類化合物

硝基咪唑類化合物起初作為放療增敏劑廣泛應用于腫瘤放射治療（圖6）。硝基作用機理與氧氣類似，在硝基自由基的參與下，受電離輻射誘導生成的DNA自由基無法重新獲得電子進行自我修復，造成不可逆的DNA損傷。受此機理的啟發，將硝基類化合物連接上更為有效DNA損傷藥物，成為低氧激活前藥發展的一個重要方向。

TH-302是基于2-硝基咪唑的前藥，在低氧條件下被單電子還原酶（如細胞色素P450還原酶）激活，通過氨基咪唑的自消除反應，發生分子的裂解，釋放DNA烷化劑溴代異磷酰胺芥（Br-IPM）（圖7）[24]。TH-302對多種腫瘤細胞展現出了抗癌活性，尤其是對存在DNA修復缺陷的細胞，如BRCA1，BRCA2或FANCA，在人肺癌H460細胞株上展現高達270倍的低氧選擇性。在臨床前研究中對多種實體瘤模型有效，包括胰腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、急性骨髓性白血病。

TH-302誘導產生靜息和增殖細胞中的DNA交聯，通過細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡來抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤生長。急性骨髓性白血病異種移植模型的體內研究表明，TH-302能夠抑制低氧細胞，延長生存期，減少白血病干細胞。小鼠在經過注射TH-302之后，生存期延長，這表明該方法可能適用于消除化療耐藥性白血病細胞，證明了通過低氧激活前藥靶向低氧腫瘤細胞的可行性。在此基礎上，TH-302進行了Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，作為實體瘤和急性白血病的單一療法。然而，結果證明其臨床效果有限，只有少數短暫的積極應答。目前，研究人員更多地選擇將低氧激活前藥與普通抗癌藥物聯合用藥用于腫瘤的治療。

TH-302與常規抗腫瘤藥物或分子靶向藥物聯合用藥的治療方法已經在多個臨床前實體瘤模型和惡性血液腫瘤中應用。在不同的腫瘤異種移植模型中，TH-302顯著增加了DNA損傷、凋亡和腫瘤壞死，減少了細胞內缺氧，同時沒有增加毒性。在胰腺癌異種移植模型中，TH-302與吉西他濱聯合用藥顯示了良好的效果；與放射治療聯合使用，TH-302能夠增強放療的抗腫瘤效果。在神經母細胞瘤和橫紋肌肉瘤異種移植模型中，TH-302與拓撲替康的聯合用藥，提高了腫瘤治療效果，延長了生存期。

然而令人失望的是，2015年12月，TH-302與吉西他濱聯合用藥用于軟組織瘤和胰腺癌的Ⅲ期臨床實驗宣告失敗，實驗結果表明藥物無法長期有效靶向腫瘤。然而，對于TH-302的研究并沒有終止，其它各項臨床實驗仍在進行中。

3 總結與展望

靶向低氧相關信號通路的研究，如HIF-1a、mTOR，是研究的熱門方向，并且已有成功上市的藥物。對于低氧激活前藥的開發，到目前為止，盡管不斷有新的化合物進入臨床研究，但是仍沒有一個成功的案例。如何解決低氧激活前藥靶向性不足的問題，將成為其研究和發展的關鍵。本單位利用2-硝基咪唑為活化基團，以7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）和紫杉醇為藥效基團，設計與合成了一系列低氧激活前藥，以解決現有低氧激活前藥靶向性不足的問題，克服低氧引起的腫瘤耐藥性[25-26]。

參考文獻

[1] Kaelin Jr WG， Ratcliffe PJ， Semenza GL. Out of breath： molecular description of cellular responses to hypoxia-2019 Nobel Prize for Physiology or Medicine[J]. Curr Sci， 2019， 117（9）： 1418-1419.

[2] Thomlinson RH， Gray LH. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy[J]. Br J Cancer， 1955， 9（4）： 539-549.

[3] Harris AL. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth[J]. Nat Rev Cancer， 2002， 2（1）： 38-47.

[4] Eales KL， Hollinshead KER， Tennant DA. Hypoxia and metabolic adaptation of cancer cells[J/OL]. Oncogenesis， 2016， 5（1）： e190. doi： 10.1038/oncsis.2015.50.

[5] Zeng W， Liu P， Pan W， et al. Hypoxia and hypoxia inducible factors in tumor metabolism[J]. Cancer lett， 2015， 356（2 Pt A）： 263-267.

[6] Wilson WR， Hay MP. Targeting hypoxia in cancer therapy[J]. Nat Rev Cancer， 2011， 11（6）： 393-410.

[7] Brown JM， Wilson WR. Exploiting tumour hypoxia in cancer treatment[J]. Nat Rev Cancer， 2004， 4（6）： 437-447.

[8] Sharma A， Arambula JF， Koo S， et al. Hypoxia-targeted drug delivery[J]. Che Soc Rev， 2019， 48（3）： 771-813.

[9] Wigerup C， P？hlman S， Bexell D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer[J]. Pharmacol ther， 2016， 164： 152-169.

[10] Semenza GL. Pharmacologic targeting of hypoxia-inducible factors[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol， 2019， 59： 379-403.

[11] Phillips RM. Targeting the hypoxic fraction of tumours using hypoxia-activated prodrugs[J]. Cancer Chemother Pharmacol， 2016， 77（3）： 441-457.

[12] Baran N， Konopleva M. Molecular pathways： hypoxiaactivated prodrugs in cancer therapy[J]. Clin Cancer Res， 2017， 23（10）： 2382-2390.

[13] Liu J， Bu W， Shi J. Chemical design and synthesis of functionalized probes for imaging and treating tumor hypoxia[J]. Chem Rev， 2017， 117（9）： 6160-6224.

[14] Semenza GL. Hypoxia-inducible factors： mediators of cancer progression and targets for cancer therapy[J]. Trends Pharmacol Sci， 2012， 33（4）： 207-214.

[15] Giaccia A， Siim BG， Johnson RS. HIF-1 as a target for drug development[J]. Nat Rev Drug Discov， 2003， 2（10）： 803-811.

[16] Poon E， Harris AL， Ashcroft M. Targeting the hypoxia- inducible factor （HIF） pathway in cancer[J]. Expert Rev Mol Med， 2009， 11： e26.

[17] Siddiqui FA， Prakasam G， Chattopadhyay S， et al. Curcumin decreases Warburg effect in cancer cells by down-regulating pyruvate kinase M2 via mTOR-HIF1α inhibition[J]. Sci Rep， 2018， 8（1）： 8323.

[18] Wong KK， Engelman JA， Cantley LC. Targeting the PI3K signaling pathway in cancer[J]. Curr Opin Genet Dev， 2010， 20（1）： 87-90.

[19] Hall MD， Failes TW， Yamamoto N， et al. Bioreductive activation and drug chaperoning in cobalt pharmaceuticals[J]. Dalton Trans， 2007（36）： 3983-3990.

[20] Phillips RM， Hendriks HR， Peters GJ. EO9 （apaziquone）： from the clinic to the laboratory and back again[J]. Br J Pharmacol， 2013， 168（1）： 11-18.

[21] Brown JM. SR 4233 （tirapazamine）： a new anticancer drug exploiting hypoxia in solid tumors[J]. Br J Cancer， 1993， 67（6）： 1163-1170.

[22] Denny WA， Wilson WR. Tirapazamine： a bioreductive anticancer drug that exploits tumour hypoxia[J]. Expert Opin Investig Drugs， 2000， 9（12）： 2889-2901.

[23] Guise CP， Wang AT， Theil A， et al. Identification of human reductases that activate the dinitrobenzamide mustard prodrug PR-104A： a role for NADPH： cytochrome P450 oxidoreductase under hypoxia[J]. Biochem Pharmacol， 2007， 74（6）： 810-820.

[24] Duan JX， Jiao H， Kaizerman J， et al. Potent and highly selective hypoxia-activated achiral phosphoramidate mustards as anticancer drugs[J]. J Medl Chem， 2008， 51（8）， 2412-2420.

[25] Jin C， Zhang Q， Lu W. Synthesis and biological evaluation of hypoxia-activated prodrugs of SN-38[J]. Eur J Med Chem， 2017， 132： 135-141.

[26] Jin C， Wen S， Zhang Q ， et al. Synthesis and biological evaluation of paclitaxel and camptothecin prodrugs on the basis of 2-nitroimidazole[J]. ACS Med Chem Lett， 2017， 8（7）： 762-765.