培養瓶制備腺病毒的收率研究

王愛霞 薛亮 胡國棟

摘 要 在293細胞培養體系中感染腺病毒后，分別培養48、72或96 h時收獲病毒，比較產量和活性，結果表明培養72 h是高產的最佳收獲時機；并討論了毒種制備的規模、后續使用特點對制備方法的限制。

關鍵詞 293細胞 腺病毒 毒種制備 病毒收獲 非完全釋放 完全釋放

中圖分類號：Q813.11 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）15-0083-03

Improvement of the process for adenovirus production

WANG Aixia*， XUE Liang， HU Guodong

（Shanghai Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT After infection with adenovirus in 293 cell culture system， adenovirus was harvested from 48 h， 72 h and 96 h culture， respectively. The yield and activity of the adenovirus were compared， and the optimum harvest time for high yield adenovirus was judged to be 72 h. The limitations of the scale of adenovirus preparation and the characteristics of subsequent use on the preparation were discussed.

KEY WORDS 293 cell； adenovirus； virus preparation； virus harvest； incomplete release； complete release

隨著過去幾十年生物制藥的普及和發展，行業內的腺病毒從實驗室到臨床對有著廣泛的研究，包括溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus）、腺病毒疫苗（adenovirus vaccine）和腺病毒基因載體（adenovirus gene therapy）。溶瘤腺病毒因E1B缺失，在正常的體細胞內不能復制，并且病毒基因組存在于細胞染色體外，不整合到細胞染色體中，避免了因整合引起的基因突變及激活致癌基因，對人體生物安全性高，所以腺病毒是目前研究進展最快的溶瘤病毒之一[1-3]。目前，腺病毒溶瘤性或基因轉導作用廣泛被用于癌癥治療領域[4]，其中溶瘤腺病毒有一個品種已上市（安柯瑞），6個品種處于臨床Ⅱ期，11個品種處于臨床Ⅰ期研究；溶瘤腺病毒疫苗有6個處于臨床Ⅱ期，3個品種處于臨床Ⅰ期研究；溶瘤腺病毒基因載體有2個品種處于臨床3期，5個品種處于臨床Ⅱ期，3個品種處于臨床Ⅰ期研究。

腺病毒可感染的細胞種類多，宿主范圍廣，幾乎可以感染所有類型的細胞。且外源基因表達水平較高，易于制備出大量高滴度的病毒，因此被廣泛運用于產業化。未來業界基礎研究的方向應強化溶瘤腺病毒免疫學相關機制的研究、突破妨礙溶瘤腺病毒研究的一些技術性瓶頸、優化細胞載體、提高溶瘤腺病毒收率和活性等[5-13]。

本研究針對完全釋放收獲方式，對腺病毒種子庫擴增技術進行了研究和分析，并討論了行業內關注的腺病毒釋放、收獲時機的把控及產量規模對收獲方式的限制，以期為提高病毒種子產量和后期適用性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

293細胞（中國武漢典型培養物保藏中心）；5型腺病毒（上海三維生物技術有限公司）；175 cm2細胞培養瓶（丹麥Nunc公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；DMEM高、低糖培養基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；J-25冷凍離心機（JA-10轉子，貝克曼庫爾特公司）；-80℃冰箱（日本Sanyo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

293細胞復蘇后，在175 cm2的細胞培養瓶中用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液培養，放入二氧化碳培養箱37 ℃培養，72 h后觀察復蘇結果，如果生長正常（無污染、無脫落、容器無破損、鏡檢視野下細胞生長率達80%以上），可用于傳代。

通常傳代后48 h即可長滿，用于繼續傳代，等傳代至所需的數量備用感染病毒。

1.2.2 病毒收獲

取生長良好的細胞，以1∶5～1∶20感染復數（multiplicity of infection，MOI）的比例接入腺病毒，在2%胎牛血清的DMEM低糖培養液中于二氧化碳培養箱、37 ℃培養，分別于48、72、96 h左右收獲病毒液。

用力拍打細胞培養瓶，使細胞瓶底面上未脫落的細胞受震蕩后脫落懸浮于培養液中。在生物安全柜中將瓶內懸液移入適當的無菌離心管內，離心（4 000 r/min，10 min，2～8 ℃），分別收獲上清液和沉淀物（細胞碎片）。沉淀物中加入10～25 ml 2%胎牛血清的DMEM低糖培養液于-80 ℃冰箱凍結后，于室溫融化，反復凍融3次。凍融后的懸液離心（8 000 r/min，10 min，2～8 ℃）收集上清液，按使用體積要求分裝、凍存。如制備的病毒用于繼續擴增，均須在無菌條件下操作。

1.2.3 病毒檢測

對凍融前上清液和凍融后的上清液分別取樣檢測病毒顆粒數和活性。用顆粒數檢測和病毒活性檢測（TCID50）來觀察改進后單批次病毒的產量及活性變化[14]。

2 結果

腺病毒從接入293細胞培養系統后，病毒感染宿主細胞需要經過一個完整的復制周期，包括病毒的吸附、穿入細胞內、脫殼、生物合成、病毒顆粒的裝配、釋放等過程，這個過程約48～96 h[15-16]。

2.1 病毒收率

48 h培養物離心前的上清液中沒有檢測出病毒顆粒（小于108 vp/ml），而凍融后上清液中病毒顆粒數為5.11×1013 vp（表1），說明培養48 h左右收獲時，病毒主要存在于培養細胞內，此時并不是病毒產量的高峰期。

72 h收獲離心前的上清液中檢測到的病毒顆粒數為 7.5×1013 vp（表1），占最終病毒產量的71.6%，說明病毒已經裝配完成并釋放至懸液中，但仍有部分病毒在細胞碎片里未釋放。72 h培養物中病毒收獲最終產量達到10.5×1013 vp，與96 h培養物的病毒產量相近，因此72 h培養是病毒產量的高峰期。

96 h收獲離心前的上清液中檢測到的病毒顆粒數為10.7×1013 vp，與最終收獲的病毒顆粒數相同，表明病毒已完全釋放至上清液中，且病毒顆粒數相較72 h培養物沒有明顯提高。

2.2 病毒活性

72 h和96 h培養物凍融前上清液中病毒總活性均高于凍融后上清液，96 h培養物凍融前上清液中病毒總活性明顯低于72 h（表1）。表明細胞外的培養體系可影響病毒活性，且隨著病毒釋放至培養液中的時間延長，活性會進一步降低。

72 h與48 h培養物凍融后離心上清液的病毒單位活性相同，因此72 h培養物在病毒收率提高的同時，活性仍保持在48 h培養物的水平；而96 h培養物中病毒單位活性明顯降低。

2.3 病毒活性比值

72 h收獲的凍融后離心上清液樣品病毒活性比值為13∶1，優于48 h和96 h收獲樣品的16∶1和17∶1，而72 h收獲的凍融前病毒活性比值（10∶1）最優（表1）。

3 討論

腺病毒感染后，可分為非完全釋放收獲和完全釋放收獲。以上述實驗為例，48 h收獲為非完全釋放收獲，收獲的具體方法可以包括物理方法如凍融，超聲破碎或低滲透壓等，以及化學方法如使用表面活性劑來裂解細胞，使病毒從細胞總釋放到營養液中，達到收獲病毒的目的；72 h和96 h為完全釋放收獲，此時，病毒依靠本身裂解細胞的能力將大部分病毒釋放到培養液，可直接從培養上清液中收獲病毒。從實驗結果來看，如果在72 h收獲時只獲取上清液（即凍融前上清液），不再對細胞進行反復凍融，可以得到病毒產量為7.5×1013 vp，病毒總活性為7.3×1012 TCID50，且病毒活性比值為10∶1的樣品，與48 h收獲相比，省去了裂解細胞和提取病毒的操作，而病毒收率和活性有顯著增加。因此從收獲產量、活性角度選擇，完全釋放收獲的方式效率更高。

在腺病毒實驗室研究和生產實踐中，非完全釋放收獲方式也有著廣泛的應用，它可濃縮制備后病毒庫的體積。非完全釋放收獲（48 h）時，收獲的培養液上清中并未檢出病毒，因此可通過離心的方式去除收獲液內被消耗營養成分及呈酸性的培養液，加入適量新鮮的培養液至離心后收集的細胞碎片，重懸凍融后可獲得濃縮后的毒種。非完全收獲方式一方面可以避免培養液產生的酸性環境導致病毒的衣殼裂解而對病毒的擴增及最終的活性起到的負面作用，另一方面加入的新鮮培養液中不含有胎牛血清，避免了培養體系中引入動物源性蛋白的風險。此外，在此過程中不需要額外的設備和病毒純化工藝介入，可以滿足實驗室規模的生產，進行臨床前或臨床階段的相關實驗。

完全釋放收獲（72 h）也有不足之處，收獲時大部分病毒已經釋放至上清中，在不能有效分離的前提下，收獲后的毒種庫體積較龐大，假設用100個175 cm2培養瓶培養腺病毒，每瓶25 ml培養體積，那么毒種總體積在2.5 L左右，而病毒濃度相對較低，這對于毒種庫后期使用有著較大的困難，需要對收獲液進行濃縮和培養液置換，增加對應的設備和工藝流程，也增加了收率損耗及產業化過程中的成本。在長滿細胞準備感染病毒的反應罐或其他大規模擴增容器中，加入較大體積含有營養成分被消耗枯竭并有細胞代謝的酸性物質的培養液，會對病毒感染早期的細胞生長有著很大的負面影響，可能直接導致病毒產率下降或失敗。

完全釋放（96 h）收獲有同樣大的收獲體積，相對72 h收獲的產量相當，但病毒活性已經大大下降，因為病毒沒有獨立代謝的能力，在96 h左右，體系中的宿主細胞已經消耗殆盡，腺病毒也逐漸失活。此時收獲，只能得到體積大、感染力較低的病毒液。假設在病毒培養過程中不斷置換培養液，并將置換出的培養液冷藏儲存，有可能在保持病毒活性的情況下最大限度地收獲病毒量，這需要對培養瓶進行額外的設計，且病毒收獲液體積也將進一步擴大，因此在產業化過程中需要進行成本考量。

綜上所述，本研究進行了利用培養瓶制備腺病毒的收獲時機的把握考察，不僅僅在于注重收獲產量，也要考慮病毒庫制備的方法對后一階段的使用的限制[10，17 ]。非完全釋放收獲方式制備毒種，相當于胞內收獲，雖然收率較低，但其優點在于體積可控，濃度較高，宿主細胞的代謝產物殘留少，可用于后續大規模反應器高密度培養。完全釋放收獲方式制備毒種的優勢在于收率較高，但在不做體積濃縮和緩沖體系置換的前提下，只適合作為體積、產量較小的高代次中間毒種庫的制備。

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