超聲輔助纖維素酶提取青龍衣多糖工藝條件優(yōu)化

李 娜，趙文婧，燕平梅，武曉英，李會(huì)珍，李曉君

（1.太原師范學(xué)院生物系，山西晉中 030619；2.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030051）

青龍衣是胡桃科（Juglandaceae） 胡桃屬（Juglands）植物核桃（Juglans regiaL.）和胡桃楸（Juglands mandshuricaMaxim.）未成熟的外果皮[1]，主產(chǎn)于東北、河北、山東、山西、陜西等地，以長(zhǎng)白山野生青核桃皮最具藥用價(jià)值[2]。青龍衣作為我國(guó)重要的藥源植物[3]，含有多種活性成分，包括多糖類、萘醌類、多酚類、黃酮類、萜類、二芳基庚院類、揮發(fā)性成分等[4-5]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌及解毒消熱消腫等生物學(xué)功效[6-8]。

植物多糖是一類含有多羥基的極性大分子化合物，具有無(wú)毒、生物活性好、與細(xì)胞相容性好等優(yōu)點(diǎn)[9]。研究表明，青龍衣中含有豐富的多糖類化合物，且其生物功效顯著。Wang R等人[10]通過(guò)研究青龍衣水溶性多糖對(duì)S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用，結(jié)果表明，青龍衣多糖對(duì)S180細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，可以對(duì)S180荷瘤小鼠免疫功能起到保護(hù)作用。胡澤成[11]以不同濃度青龍衣多糖處理結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)青龍衣多糖可以抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，并對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用。近年來(lái)，由于青龍衣多糖具有顯著的腫瘤活性，對(duì)青龍衣多糖的研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)青龍衣多糖化學(xué)成分及其生物活性的研究報(bào)道越來(lái)越多。

目前，國(guó)內(nèi)外多糖的提取方法主要有傳統(tǒng)水提-醇沉法、溶劑浸提法、熱回流提取法、生物酶法、超臨界流體法等[12-13]。王紅霞等人[14]采用水提-醇沉法比較了不同品種、不同時(shí)期核桃青皮多糖的含量，結(jié)果表明，所有核桃品種外皮多糖含量均在硬化期達(dá)到最高。任曉蕾等人[15]采用響應(yīng)面法對(duì)核桃青皮多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)提取溫度88℃，料液比1∶22，提取時(shí)間72 min時(shí)，多糖提取量可達(dá)7.83 mg/g。生物酶法成為近期天然產(chǎn)物提取的研究熱點(diǎn)。通過(guò)酶解法將青龍衣組織結(jié)構(gòu)和大分子物質(zhì)破壞，再利用超聲波強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和攪拌作用等[16]進(jìn)一步破壞細(xì)胞組織，使植物組織細(xì)胞中的多糖充分溶出[17]，同時(shí)采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而提高提取效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青龍衣，于2019年7-8月購(gòu)自山西省沁縣。

葡萄糖（色譜純）、DPPH（分析純）、ABTS（分析純）、纖維素酶（酶活力50 U/mg），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；其他有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)分別考查粉粹粒度（60，80，100，120，140目）、料液比 （1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50）、纖維素酶添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）、超聲時(shí)間 （20，40，60，80，100 min）、酶解溫度 （25，35，45，55，65℃）、超聲功率（200，400，600，800，1 000 W） 對(duì)青龍衣多糖提取量的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 10.0.3.1、Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選擇料液比（X1）、超聲時(shí)間（X2）、酶解溫度（X3）、纖維素酶添加量（X4）為考查變量，以多糖提取量（Y）為響應(yīng)值。

超聲波提取青龍衣多糖響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 超聲波提取青龍衣多糖響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3 青龍衣多糖提取量測(cè)定

將青龍衣洗凈，置于50℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎、過(guò)篩，干燥備用。精密稱取青龍衣粉末1.0 g，加入一定的纖維素酶量，依料液比加入蒸餾水，放入特定溫度和超聲功率的超聲波清洗機(jī)中，酶解一定的時(shí)間；過(guò)濾提取液、沉淀、離心，取上清液備用；采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

粉碎粒度、料液比、纖維素酶添加量對(duì)青龍衣多糖提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 粉碎粒度、料液比、纖維素酶添加量對(duì)青龍衣多糖提取量的影響

由圖1可知，青龍衣多糖提取量隨青龍衣粉碎粒度的增加而增加，當(dāng)粉碎粒度超過(guò)100目后，多糖提取量逐漸降低，可能原因是隨著粉碎粒度的增大，青龍衣粉末與提取溶劑充分接觸，使多糖容易溶出，但隨著粉碎粒度繼續(xù)增大時(shí)，導(dǎo)致青龍衣物料過(guò)細(xì)，使青龍衣粉碎物極易吸附結(jié)塊，從而增加了傳質(zhì)阻力，降低傳質(zhì)速率，不利于多糖的溶出[18]。因此，選擇合適的粉碎粒度為100目。

由圖1可知，青龍衣多糖提取量隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比超過(guò)1∶20后，多糖提取量趨于穩(wěn)定，可能原因是隨著液料比的增大，青龍衣多糖與提取溶劑的濃度差增大，提高了傳質(zhì)速率[19]，多糖更易溶出，隨著料液比繼續(xù)增大時(shí)，極大的濃度差導(dǎo)致青龍衣其他組分的溶出，使得多糖提取量的增加不明顯。因此，選擇合適的料液比為1∶20。

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，青龍衣多糖提取量增加，當(dāng)酶添加量超過(guò)1.5%時(shí)，多糖提取量增加緩慢?？赡茉蚴牵S著酶添加量的增加，植物組織在纖維素酶的作用下逐漸水解完全，有利于多糖的釋放，從而提高多糖提取量；但隨著酶添加量的繼續(xù)增加，有限的底物濃度限制了多糖的溶出，或者多糖被包裹在纖維素酶中[20]，從而使得多糖提取量趨于不變。因此，選擇合適的酶添加量為1.5%。

超聲時(shí)間、酶解溫度、超聲功率對(duì)青龍衣多糖提取量的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，青龍衣多糖提取量增加，但在超過(guò)50 min時(shí)，多糖提取量緩慢下降，可能原因是，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，青龍衣組織細(xì)胞被破壞得更加充分，有利于酶解的進(jìn)一步作用，使多糖更易溶出，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，持續(xù)高溫可能在一定程度上對(duì)多糖分子的結(jié)構(gòu)具有破壞作用，或者使多糖分解為單糖[21]，從而使得多糖提取量降低。因此，選擇合適的超聲時(shí)間為50 min。

圖2 超聲時(shí)間、酶解溫度、超聲功率對(duì)青龍衣多糖提取量的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，青龍衣多糖提取量逐漸增加，但當(dāng)溫度高于45℃以后，多糖提取量逐漸下降，可能原因是，試驗(yàn)所用纖維素酶的最適溫度為45～55℃，隨著酶解溫度的升高，纖維素酶活性增大，酶解作用也相應(yīng)增強(qiáng)，多糖提取量隨之增加，但當(dāng)試驗(yàn)溫度超過(guò)酶的最適溫度后，高溫使得纖維素酶的活性逐漸降低，或者持續(xù)的高溫使部分多糖降解[22]，從而導(dǎo)致青龍衣多糖的提取量下降。因此，選擇合適的酶解溫度為45℃。

由圖2可知，隨著超聲功率的升高，青龍衣多糖提取量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為600 W時(shí)，多糖提取量最大為7.92 mg/g。原因可能是，適當(dāng)功率的超聲波對(duì)植物組織細(xì)胞具有破壞作用，有利于組織細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)有效成分的釋放。但是，較大的超聲功率極易造成多糖分子鏈的斷裂，或者對(duì)組織細(xì)胞的破壞作用更徹底，從而使與目標(biāo)成分存在萃取競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的非目標(biāo)物質(zhì)溶出[13]，從而使得多糖提取量降低。因此，選擇合適的超聲功率為600 W。

各單因素試驗(yàn)中，綜合考慮多糖提取量及試驗(yàn)成本等因素，確定粉碎粒度100目，料液比1∶20，纖維素酶添加量1.5%，超聲時(shí)間50 min，酶解溫度45℃和超聲功率600W為青龍衣多糖的最佳基本提取條件。各單因素試驗(yàn)除粉碎粒度和超聲功率外，不同條件對(duì)青龍衣多糖提取量的影響范圍為2.02～3.70 mg/g，不同粉碎粒度和超聲功率對(duì)多糖的影響范圍分別為0.81，0.91 mg/g。因此，試驗(yàn)僅將料液比、超聲時(shí)間、酶解溫度、纖維素酶添加量列入響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化因素中，而粉碎粒度和超聲功率并未列入響應(yīng)面優(yōu)化因素中。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面模型及顯著性檢驗(yàn)

將料液比、超聲時(shí)間、酶解溫度、纖維素酶添加量作為曲面響應(yīng)法考查的4個(gè)單因子，以多糖提取量（mg/g）為響應(yīng)值，四因子三水平29個(gè)組合的曲面響應(yīng)法分析試驗(yàn)結(jié)果。多糖提取量的變幅為5.04 mg/g（8號(hào)試驗(yàn)） 到8.81%（1號(hào)試驗(yàn)）。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 多糖提取量的響應(yīng)面分析

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果

運(yùn)用Design Expert 10.0.3.1軟件對(duì)表2所示多糖提取量進(jìn)行的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的響應(yīng)面回歸擬合，得出多糖提取量響應(yīng)值（Y）和各因素（X1，X2，X3，X4）間二次回歸模型：

二次多項(xiàng)式模型的方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，試驗(yàn)各因素對(duì)多糖提取量的影響順序依次為纖維素酶添加量>料液比>酶解溫度>超聲時(shí)間。

由表3可知，多糖提取量的二次多項(xiàng)式擬合模型極顯著（p<0.000 1)，F(xiàn)值為21.28，其失擬項(xiàng)p=0.335 7>0.05不顯著。因此，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，此模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合性較好；擬合系數(shù)R2值是0.955 1，說(shuō)明該模型能夠闡明95.51%的響應(yīng)值的變化。信噪比Adep Precision（14.406） 大于4，說(shuō)明該模型的回歸方程的可信度較高。變異系數(shù)為4.5，說(shuō)明模型穩(wěn)定性較好。由此可以看出，響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助酶解法提取青龍衣多糖的工藝可靠并且穩(wěn)定性好，可以用該模型對(duì)料液比、超聲時(shí)間、酶解溫度、酶添加量對(duì)多糖提取量進(jìn)行優(yōu)化和分析。

表3 二次多項(xiàng)式模型的方差分析

由表3可知，料液比-酶添加量二次項(xiàng)、超聲時(shí)間-酶添加量二次項(xiàng)對(duì)多糖提取量呈現(xiàn)顯著水平；料液比一次項(xiàng)、超聲時(shí)間一次項(xiàng)、酶解溫度一次項(xiàng)、酶添加量一次項(xiàng)、超聲時(shí)間-酶解溫度二次項(xiàng)、酶解溫度-酶添加量二次項(xiàng)呈現(xiàn)極顯著水平；料液比-超聲時(shí)間二次項(xiàng)、料液比-酶解溫度二次項(xiàng)不顯著。

2.2.3 青龍衣多糖提取最優(yōu)條件的確定及驗(yàn)證

使用Design Expert 10.0軟件對(duì)多元二次回歸方程求一階偏導(dǎo)，得到在料液比1∶23.28，超聲時(shí)間44.04 min，酶解溫度47.54℃，纖維素酶添加量1.55%的條件下多糖提取量達(dá)到8.70%。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作的可行性，將上述途徑修正為料液比1∶23，超聲時(shí)間44 min，酶解溫度48℃，酶添加量1.55%，在修正后的試驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，青龍衣多糖的平均提取量為9.43 mg/g，其誤差為0.73%，試驗(yàn)值與理論值基本吻合，說(shuō)明回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對(duì)青龍衣多糖提取量的影響。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定最佳提取條件為料液比1∶23，超聲時(shí)間44 min，酶解溫度48℃，酶添加量1.55%。在此條件下青龍衣多糖提取量達(dá)到9.94 mg/g。采用超聲輔助纖維素酶提取青龍衣多糖的方法具有成本低廉、方法簡(jiǎn)便易行的優(yōu)點(diǎn)，為青龍衣多糖大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化提取加工提供一定理論依據(jù)和技術(shù)參照。