Box-Behnken設計-響應面法優化滇龍膽藥材產地初加工工藝

吳昕怡 劉秀嶶 屈云慧 石萍萍 楊雁 李智敏 田浩 谷麗萍

摘 要 目的：優化滇龍膽藥材的產地初加工工藝。方法：采用高效液相色譜法測定滇龍膽中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和龍膽苦苷的含量，再以上述3種成分含量的總評歸一值（OD值）為評價指標，對熱燙溫度、熱燙時間和干燥溫度進行單因素試驗;在此基礎上，采用Box-Behnken設計-響應面法優化滇龍膽藥材產地初加工工藝并進行驗證，再與陰干樣品進行比較。結果：滇龍膽藥材產地初加工最優工藝為熱燙時間5 min，熱燙溫度40 ℃，烘干溫度60 ℃。驗證試驗結果顯示，滇龍膽藥材中3種成分的平均OD值為0.565 2，與預測值（0.570 6）的偏差為0.94%。與陰干樣品比較，滇龍膽最優工藝樣品中3種成分含量的OD值明顯升高，表明優化工藝加工的滇龍膽樣品質量更好。結論：優化的工藝穩定、可行，可用于滇龍膽藥材的產地初加工。

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the primary processing technology of Gentiana rigescens. METHODS： HPLC method was adopted for content determination of loganic acid， swertiamarin and gentiopicroside in G. rigescens， and overall desirability value （OD value） of the contents of above 3 components was taken as index to carry out single factor test on blanching temperature， blanching time and drying temperature. Based on that， Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize primary processing technology of G. rigescens. Validation test was also performed. The samples prepared by optimized technology were compared with those dried in the shade. RESULTS： The optimal primary processing technology of G. rigescens included blanching time of 5 min， blanching temperature of 40 ℃ and drying temperature of 60 ℃. Validation test showed that the average OD value of the 3 components was 0.565 2， with a deviation of 0.94% from the predicted value （0.570 6）. Compared with samples dried in the shade， OD value of 3 components in samples prepared by optimized technology were increased significantly， indicating the quality of the samples prepared by the optimized technology was better. CONCLUSIONS： The optimal technology is stable and feasible， and can be used for the primary processing of G. rigescens.

KEYWORDS? ?Gentiana rigescens; Primary processing technology; Box-Behnken design; Response surface method; Overall desirability value

產地初加工直接關系到中藥材的質量及療效[1-2]，而落后的加工經驗和水平已嚴重制約了道地藥材規?；?、產業化的發展[2]。產地初加工是中藥材采摘后加工的第一環節，更是藥材品質形成的關鍵環節[3-4]。適宜的產地初加工方法，可以有效保留有效物質、提升藥材品質。例如陰干處理的三七外觀品質較優、質地堅實，且總皂苷、三七素等有效成分含量較高[5];蒸、煮法處理天麻可分別提高其天麻素含量達2.0、2.5倍[6]。

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl）是龍膽科龍膽屬多年生草本植物，以根和根莖入藥[7]，是云南道地藥材，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效[8]。現代藥理學研究表明，其有效成分為馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷等裂環烯醚萜類化合物[9-10]。滇龍膽藥材為春、秋二季采挖，加工方式為洗凈、干燥[7]。本課題組前期調研發現，其產地初加工工藝主要為清水洗后直接干燥（晴天時采用曬干，陰天時采用陰干）;農戶憑主觀經驗操作，隨意性較大，缺乏系統性、標準化的初加工規范，導致藥材中有效成分含量高低不一。相關研究發現，產地初加工工藝、水洗時間、干燥溫度對龍膽苦苷的含量具有顯著影響[11-12]，水洗陰干的滇龍膽中龍膽苦苷含量較高，但工藝操作耗時長、成本高、效率低[13]。另有研究發現，含苷類中藥如黃芩[14]、菊花[15]等在采摘后均會進行熱燙處理，能殺死植物細胞、使酶滅活，提高藥材質量。基于此，本課題組以滇龍膽主要有效成分馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量的總評歸一值（OD值）為考察指標，以熱燙時間、熱燙溫度、干燥溫度為考察因素，采用Box-Behnken設計-響應面法優化滇龍膽產地初加工工藝，以期為后期改進、規范滇龍膽道地藥材的產地初加工方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters1525型高效液相色譜儀，包括1525二元高壓梯度泵、2707型自動進樣器、2998二極管陣列檢測器、Breeze2分析系統（美國Waters公司）;AUY220型分析天平（日本Shimadzu公司）;KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;HGZF-9053型臺式電熱鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司）;XMT-DA型電熱恒溫水浴鍋（余姚市亞星儀器儀表有限公司）。

1.2 藥品與試劑

滇龍膽藥材于2019年1月采自云南省臨滄市，經云南省農業科學藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為龍膽科龍膽屬植物滇龍膽（G. rigescens Franch. ex Hemsl）的根莖;馬錢苷酸對照品（批號：P01A9L67139，純度：≥98%）、獐牙菜苦苷對照品（批號：S02D7D26161，純度：≥98%）、龍膽苦苷對照品（批號：R20O8F46237，純度：≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司;甲醇、甲酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 滇龍膽藥材中主要有效成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 參考Pan Y等[16]的方法。色譜柱為Phenpmenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1.5 min，7%A→10%A;1.5～15 min，10%A→26%A;15～24 min，26%A→54%A;24～36 min，54%A→90%A）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為243 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對照品4.8、5.2、10.4 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，制成馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷質量濃度分別為0.48、0.52、1.04 mg/mL的混合對照品溶液，于4 ℃避光保存，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 參考Zhang JY等[17]的方法，取滇龍膽陰干樣品（取新鮮滇龍膽藥材，洗凈，陰干，即得;下同）適量，打粉，過三號篩。取藥材粉末0.2 g，置于5 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，混勻，稱定質量，超聲（功率：40 kHz，頻率：600 W）提取1 h，再稱定質量，用甲醇補足損失質量，混勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 專屬性試驗 取空白對照溶液（甲醇溶液）和“2.1.2”項下混合對照品溶液、“2.1.3”項下供試品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，空白對照無干擾（圖略），供試品溶液與混合對照品溶液在相應位置有相同色譜峰，理論板數以獐牙菜苦苷計不低于2 000，且各色譜峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，表明本方法專屬性強。色譜圖見圖1。

2.1.5 線性關系、檢測限與定量限考察 取“2.1.2”項下的混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣1、5、10、15、20、30 μL進行分析，記錄色譜圖。以待測物進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積為縱坐標（y）進行回歸分析。另取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，用甲醇逐級稀釋后進樣分析，以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1分別計算檢測限、定量限。3種待測成分的回歸方程、線性范圍、檢測限和定量限見表1。

2.1.6 精密度試驗 取”2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為0.46%、0.41%、0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液適量，在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h后按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為1.48%、2.60%、1.56%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 稱取滇龍膽陰干樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，根據標準曲線法計算3種成分的含量。結果，馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量的RSD分別為1.55%、1.55%、0.97%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量的滇龍膽陰干樣品0.1 g，平行6份，加入馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷質量濃度分別為0.26、0.102、2.6 mg/mL的混合對照品溶液（按”2.1.2”項下方法制備）2 mL，用甲醇溶解并定容后，按”2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷的平均加樣回收率分別為96.09%、102.74%、102.05%，RSD分別為1.91%、1.23%、1.53%（n=6），表明該方法的準確度良好，詳見表2。

2.2 單因素試驗

通過本課題組前期調研及預試驗發現，熱燙溫度、熱燙時間和烘干溫度對滇龍膽藥材中有效成分馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷的含量影響較大，因此以這3個因素進行加工工藝的單因素考察。為了使試驗結果較全面地反映滇龍膽的質量，本研究利用Hassan法[18]對實際測得的馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量進行歸一化，然后以三者的OD值作為評價指標進行試驗：先將各成分含量的數值標準化為0～1之間的歸一值（d），公式為di=（yi-ymax）/（ymax-ymin），其中di表示歸一化后某成分的含量，yi表示歸一化前某成分的含量，ymin表示歸一化前某成分的最小含量，ymax表示歸一化前某成分的最大含量;再根據各成分的d值求算幾何平均值，即得這3種成分的OD值，OD值越高，表明滇龍膽藥材質量越好。

2.2.1 熱燙時間的考察 取新鮮滇龍膽藥材，共5份，洗凈，置于60 ℃水浴鍋中，分別熱燙處理1、2、3、4、5 min，再置于40 ℃烘箱中烘干至水分符合2015年版《中國藥典》（一部）中龍膽藥材的含水量規定（不得小于9.0%，下同）[7]。取不同熱燙時間處理并烘干后的滇龍膽樣品，打粉，過三號篩，取適量粉末，按”2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，根據標準曲線法計算馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量，再計算OD值。結果，隨著熱燙時間的增加，滇龍膽中3種有效成分的OD值呈先升高后降低的趨勢;當熱燙處理4 min時，OD值最大，詳見表3。

2.2.2 熱燙溫度的考察 取新鮮滇龍膽藥材，共5份，洗凈，分別置于40、50、60、70、80 ℃水浴鍋中，熱燙處理4 min，再置于40 ℃烘箱中烘干至水分符合要求。取不同熱燙溫度處理并烘干后的滇龍膽樣品，打粉，過三號篩，取適量粉末，按”2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，根據標準曲線法計算馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量，再計算OD值。結果，隨著熱燙溫度的升高，滇龍膽中3種成分的OD值呈先升高后降低的趨勢;當熱燙溫度為60 ℃時，OD值最大，詳見表4。

2.2.3 烘干溫度的考察 取新鮮滇龍膽藥材，共5份，洗凈，置于60 ℃水浴鍋中，熱燙處理4 min，然后分別置于30、40、50、60 ℃烘箱中烘干至水分符合要求。取熱燙處理并在不同溫度下烘干后的滇龍膽樣品，打粉，過三號篩，取適量粉末，按”2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，根據標準曲線法計算馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量，再計算OD值。結果，隨著烘干溫度的升高，滇龍膽中3種成分的OD值呈先升高后降低的趨勢;當烘干溫度為50 ℃時，OD值最大，詳見表5。

2.3 Box-Behnken設計-響應面法優化滇龍膽產地初加工工藝

2.3.1 試驗設計 根據單因素試驗結果，以熱燙時間（A）、熱燙溫度（B）、烘干溫度（C）為自變量，以OD值為因變量（Y），設計3因素3水平的Box-Behnken試驗。因素與水平見表6，試驗設計與結果見表7。

2.3.2 模型擬合與方差分析 利用Design Expert 8.0.5軟件對試驗數據進行擬合，并建立二次多元回歸方程：Y=0.276 5+0.026 0A-0.062 8B+0.056 2C-0.047 3AB+0.049 8AC-0.044 0BC-0.019 3A2+0.093 2B2-0.066 0C2（R2=0.965 6）。對其進行方差分析，結果見表8。

由表8可知，模型F=21.806 1，P=0.000 3（<0.001），表明該模型擬合程度良好;另外，R2=0.965 6，說明因變量的變化有96.56%來源于自變量，因此可用此模型和方程來分析預測滇龍膽藥材產地初加工的工藝條件。各因素對滇龍膽產地初加工工藝的影響程度大小排序依次為B>C>A，即熱燙溫度>烘干溫度>熱燙時間，且3種因素的影響均具有統計學意義（P<0.05）。

為進一步評價各因素之間的交互作用對滇龍膽藥材產地初加工工藝的影響并確定最優工藝，本研究采用Design Expert 8.0.5軟件繪制響應面圖和等高線圖，并進行分析，結果見圖2。

由圖2A可知，隨著熱燙溫度的增加，OD值的變化不明顯，而隨著熱燙時間的增加，OD值呈增加的趨勢，響應面有傾斜度;由圖2B可知，OD值隨烘干溫度和熱燙時間的增加均分別呈現先升高后降低的趨勢，響應面相對平緩，等高線呈圓環狀;由圖2C可知，隨著熱燙溫度的增加，OD值的變化不明顯，而隨著烘干溫度的增加，OD值呈現升高的趨勢，響應面有傾斜度。結合表8可知，熱燙時間與熱燙溫度兩個因素之間、烘干溫度與熱燙時間兩個因素之間的交互作用極顯著（P<0.01）;熱燙溫度與烘干溫度兩個因素之間的交互作用顯著（P<0.05）。進一步得到滇龍膽藥材產地初加工工藝最優工藝參數為熱燙時間5 min，熱燙溫度50 ℃，烘干溫度60 ℃;其預測OD值為0.570 6。

2.3.3 最優工藝驗證及與陰干方法的比較 取新鮮滇龍膽藥材，洗凈，按“2.3.2”項下最優工藝參數進行處理，平行制備3批最優工藝樣品;同時，另取新鮮滇龍膽藥材，洗凈，平行制備3批陰干樣品。取各樣品打粉，過三號篩，取適量粉末，按”2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，根據標準曲線法計算3種成分含量，并計算OD值，詳見表9。結果，最優工藝所得滇龍膽藥材中3種成分含量的平均OD值為0.565 2，與預測值（0.570 6）的偏差為0.94%，表明優化后的工藝穩定可行;與滇龍膽陰干樣品比較，滇龍膽最優工藝樣品3種成分含量的OD值明顯升高，表明優化工藝加工的滇龍膽樣品質量更好。

3 討論

中藥材產地初加工工藝對提高藥材有效成分的含量具有重要意義。相關研究表明，滇龍膽中的有效成分以裂環烯醚萜類化合物馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷為主;該類化合物含有縮醛結構，在水中的穩定性較差，因此在滇龍膽藥材加工過程中易受水洗、干燥溫度、酶解等過程的影響[12，19-22]。早期相關研究采用單因素試驗考察了滇龍膽產地初加工工藝，但忽略了各因素間的相互作用，導致研究結果不一致。例如，米麗菊等[23]的研究表明，藥材曬干有利于活性成分的保留;然而左智天等[13]的研究表明，藥材陰干有利于活性成分的保留。

近年來，響應面法開始應用于藥材的加工炮制領域[24]。該方法是在傳統各因素的“點”數據基礎上對多因素整體的“面”數據進行科學性分析，最終精確找到最優的“點”[25]。基于此，本研究采用Box-Behnken設計-響應面法優化滇龍膽初加工工藝，在前期調研和預試驗的基礎上，選擇熱燙時間、熱燙溫度、烘干溫度為考察因素，最終確定最優的工藝參數為熱燙時間5 min、熱燙溫度40 ℃、烘干溫度60 ℃。

對于含苷類中藥材的加工常采用烘干、炒制、蒸制、暴曬、熱燙等方式來抑制或破壞藥材內在酶的活性，以防止加工過程中苷類物質的破壞[26]。例如，生梔子在90 ℃水中熱燙10 min后制得的干品中梔子苷的含量遠高于生梔子[27]。本研究也有類似發現，熱燙時間和熱燙溫度均對滇龍膽中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量的OD值具有顯著影響（P<0.05）。從單因素試驗結果可知，采用過低溫度或者過高溫度熱燙處理的滇龍膽藥材的OD值均不高，推測其原因可能是由于過低的溫度未有效滅活滇龍膽藥材中的酶，而過高的溫度增加了滇龍膽中有效成分的水溶性，從而影響滇龍膽質量。另外，本研究將最優工藝所制得的滇龍膽樣品與其陰干樣品進行比較，結果發現，最優工藝樣品中3種成分含量的OD值均高于陰干樣品，由此可知熱燙、烘干可提高滇龍膽藥材質量。

綜上所述，本研究優化了滇龍膽藥材的產地初加工工藝，且經該工藝制得的滇龍膽藥材質量較好，這可為滇龍膽藥材產地初加工的質量控制、工藝標準化提供參考。

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（收稿日期：2020-04-23 修回日期：2020-06-03）

（編輯：唐曉蓮）