豬骨骼肌衛星細胞分離培養、鑒定及其生物學特性

秦本源，楊陽，張燕偉，劉敏，張萬鋒，王海珍，吳怡琦，張雪蓮，蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

豬骨骼肌衛星細胞分離培養、鑒定及其生物學特性

秦本源，楊陽，張燕偉，劉敏，張萬鋒，王海珍，吳怡琦，張雪蓮，蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801）

【目的】建立豬骨骼肌衛星細胞體外分離、純化及鑒定的方法，并對其生物學特性進行探討，為進一步研究豬肌肉生長發育提供良好的細胞模型。【方法】選取1日齡仔豬背最長肌為材料，無菌狀態下將背最長肌剪碎為肉糜狀。此后采用濃度為0.2%的Ⅰ型膠原酶消化90 min，再加入濃度為0.25%的胰蛋白酶37 ℃聯合消化30 min。經終止消化、過濾、重懸后將分離得到的細胞置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。選用反復差速貼壁法對骨骼肌衛星細胞進行純化，第一次純化選擇在細胞接種2 h后，將未貼壁細胞轉移至新培養皿。上清液繼續培養18 h后，對衛星細胞進行第二次差速貼壁純化。當細胞密度達70%—80%時可對細胞進行傳代或凍存處理。利用細胞免疫熒光技術檢測P2代衛星細胞標志基因、的蛋白表達情況，并繪制衛星細胞生長曲線。分別添加不同誘導分化液使衛星細胞定向分化為肌細胞、脂肪細胞、成骨細胞，檢測成肌分化標志基因的免疫熒光，鑒定衛星細胞肌管形成情況；油紅O染色及油紅O定量鑒定衛星細胞誘導成脂分化效果；茜素紅染色鑒定衛星細胞成骨分化能力，qRT-PCR檢測成肌、成脂、成骨進程中關鍵基因的表達。【結果】通過兩步酶消化和反復差速貼壁法分離純化得到了純度較高的衛星細胞，剛分離的細胞折光性強，貼壁后呈梭形或紡錘形，此后細胞延展并開始快速增殖。衛星細胞特異標志蛋白Pax7、MyoD細胞免疫熒光鑒定結果呈陽性，表明分離細胞為骨骼肌衛星細胞。骨骼肌衛星細胞增殖過程經潛伏期、生長期最終達到平臺期，細胞生長曲線呈“S”型。當細胞生長至90%密度時，衛星細胞會出現自融合現象。對分離的骨骼肌衛星細胞成肌誘導分化后，可見鄰近衛星細胞融合形成大量粗長肌管，多核肌管呈方向性排列，成肌標志蛋白MHC染色呈陽性。qRT-PCR結果顯示標志基因在成肌誘導分化過程中二者均呈先上升后下降趨勢。經成脂誘導后細胞形態變為三角形，連續誘導發現脂滴出現并聚集成大脂滴，油紅O染色可見大量紅色葡萄樣脂滴。油紅O定量檢測結果表明，成脂誘導過程中甘油三酯含量呈穩步上升趨勢，各時間點均存在極顯著差異（＜0.01）。qRT-PCR結果顯示，基因表達量在誘導中后期高表達；在誘導分化第6天達到最高，極顯著高于其余時間點（＜0.01）；和表達趨勢一致，均呈先升高后降低趨勢。誘導成骨分化后，發現細胞形態變為不規則狀，誘導后期細胞復層生長形成骨鈣結節，茜素紅染色可見圓形不透明鈣化結節，數量和密度較未誘導時期都明顯增加，結果表明細胞出現成骨向分化。成骨標志基因、的表達量也隨誘導進程呈穩步上升趨勢，相比未誘導細胞差異極顯著（<0.01）。【結論】建立了基于聯合酶消化和反復差速貼壁實現豬骨骼肌衛星細胞分離和純化的方法，所得細胞增殖能力強且具有多向分化潛能，為豬骨骼肌衛星細胞作為種子細胞用于未來組織工程研究提供了技術平臺。

豬；衛星細胞；分離培養；鑒定；分化

0 引言

【研究意義】骨骼肌衛星細胞（satellite cells, SCs）位于肌纖維膜與基底膜之間，屬于肌源性干細胞[1]，具有較強的增殖、分化潛能。正常哺乳動物體內，骨骼肌衛星細胞通常處于靜息狀態，但當肌肉組織受到高強度訓練、損傷或其他外界刺激時，衛星細胞便被激活[2]。此后衛星細胞進入細胞周期，通過增殖、遷移、分化、融合等一系列復雜的生物學過程，最后形成新的肌纖維，以恢復正常的組織結構，維持骨骼肌的生長發育[3-5]。因此，衛星細胞可作為組織工程的種子細胞對機體相關疾病的治療具有重大意義。豬骨骼肌衛星細胞是探究豬肌肉形成過程的良好模型，建立體外肌衛星細胞的分離培養體系對探索豬肌肉生長發育過程具有指導意義，也可為衛星細胞移植在臨床中的應用提供參考。【前人研究進展】骨骼肌衛星細胞最先由Mauro于1961年在青蛙的脛前肌中發現，電子顯微鏡下觀察到其位置分布緊貼于肌細胞的表面[6]。衛星細胞的數量隨年齡的增加而逐漸減少，細胞核總數在出生后一段時期內明顯下降，當達到一定程度后可終身維持[7-8]。相較于動物幼齡期而言，成年后衛星細胞含量較低，約占1%—5%[9]。先前研究已表明，各種分子標記是不同階段細胞鑒定的基礎，骨骼肌衛星細胞的特異性基因可作為骨骼肌衛星細胞鑒定的常用方法。判定衛星細胞最常用的標志基因是、和[10]。配對盒基因7（pired box 7, Pax7）作為骨骼肌衛星細胞的標志基因，在靜息期和增殖期均有表達[11]，已有的研究結果證明對衛星細胞的成肌分化是必須的，只有當正常表達時才具備對肌肉損傷的修復功能[12]。生肌決定因子（myogenic determination gene, MyoD）可引導衛星細胞向成肌細胞分化，缺陷型小鼠的衛星細胞無法參與分化進程，阻礙肌纖維的修復[13]。肌細胞生成素（myogenin, MyoG）主要在分化的中后期表達，可作為成肌分化的標志，當衛星細胞融合形成肌管時，表達量的升高會促進肌衛星細胞終末分化。肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain, MHC）基因最后表達，標志著分化已進入終末時期，肌管形成[14]。目前，關于衛星細胞的分離主要有單根肌纖維法[15]和酶消化法[16]。其中酶消化法又可分為鏈霉蛋白酶消化法[17]和兩步酶消化法[18]，即采用膠原酶胰酶聯合消化，此法可將肌纖維中的衛星細胞釋放，分離得到較多衛星細胞。盡管酶消化法提高了衛星細胞得率，但不可避免地引入了其它的非肌源性細胞，如成纖維細胞、紅細胞等[19]。因此，科學家們又對衛星細胞的純化進行了改良，當前常用的純化方法主要有差速貼壁法[20]、Percoll梯度密度離心法[21]、流式細胞分選術[22]和免疫磁珠細胞分選術[23]等。骨骼肌衛星細胞自被證實具有干細胞特性以來便引起了廣大研究者的關注，已有的研究結果發現，骨骼肌衛星細胞除了可以向成肌方向分化外，在不同誘導環境下也可以成脂分化形成脂滴或成骨分化形成鈣沉淀[24-25]。【本研究切入點】快速簡潔高效地分離高純度骨骼肌衛星細胞成為了當前研究的熱點，體外骨骼肌衛星細胞的分離已在小鼠[26]、雞[27]、牛[28]、羊[29]等動物上成功獲得，但在豬上研究較少，對豬骨骼肌衛星細胞生物學特性及多向分化潛能研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】故本研究選取1日齡仔豬背最長肌為材料，采用兩步酶消化法成功分離豬骨骼肌衛星細胞并對其鑒定，此后分別誘導成肌、誘導成脂、誘導成骨檢測其多向分化潛能。分離培養高純度的骨骼肌衛星細胞，有利于探明其細胞生物學特性，也為家畜遺傳資源改良和相關疾病治療奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.1.1 試驗動物 選取1日齡大白豬，體重1 kg，購自山西省清徐縣天祿豐種豬育種有限公司。試驗于2019年3—7月在山西農業大學動物科技學院動物遺傳育種與繁殖實驗室完成。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養基、胎牛血清FBS、馬血清HS均購自Gibco公司；胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、PBS、油紅O染液、茜素紅染液（pH= 4.2）、4%多聚甲醛、Triton X-100、DAPI均購自Solaibio公司；2%即用型山羊血清封閉液購自博士德生物工程有限公司；Ⅰ型膠原酶、地塞米松（DEX）、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、羅格列酮、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸均購自美國Sigma公司；Anti-Pax7、Anti-MHC、Anti-MyoD購自Abcam公司；FITC標記羊抗鼠IgG二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；反轉錄和實時熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.2 骨骼肌衛星細胞的分離及純化

無菌采集仔豬背最長肌組織，先后置于75%乙醇、含2%雙抗的PBS中清洗數次，在預冷的PBS中除去肉眼可見的血管、筋膜等結締組織，剪碎為1 mm3的組織塊。轉移組織塊至無菌離心管中，用含0.2%的Ⅰ型膠原酶置于搖床消化90 min，期間每隔15 min吹打消化液一次。再用0.25%胰蛋白酶37 ℃消化30 min，期間每隔10 min晃動混勻一次。消化結束后，用等體積完全培養基（10% FBS+1%雙抗+DMEM高糖）終止消化，依次過70目、200目細胞篩。濾液1 000 r/min離心5 min，重懸細胞并接種至60 mm細胞培養皿中。置于體積分數為5% CO2、37 ℃培養箱中培養2 h后將上清吸至新皿中，記為P01。P01細胞繼續培養18—24 h后再次轉移上清，記為P02。其中，P01、P02即為純化后的骨骼肌衛星細胞，培養48 h后首次換液，之后每2 d更換一次完全培養基。

1.3 骨骼肌衛星細胞的傳代與凍存

待培養皿中細胞生長匯合至70%—80%時，按照1﹕2或1﹕3的比例傳代培養，隔天換液，倒置顯微鏡下觀察。衛星細胞的凍存取消化后的細胞用細胞凍存液（20% FBS+10% DMSO+DMEM）重懸，吹打混勻后加入凍存管中，-80℃冰箱過夜，取出后投入液氮中保存。復蘇時從液氮中取出細胞，立刻放入37℃水浴鍋中快速融化，離心去上清后用新鮮的完全培養基重懸接入新培養皿。

1.4 骨骼肌衛星細胞的免疫熒光染色鑒定

選P2代骨骼肌衛星細胞接種于24孔細胞培養板，待細胞密度達到50%左右時開始細胞免疫熒光染色。PBS漂洗細胞3次后，用4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min。0.1% Triton X-100通透細胞30 min，蒸餾水洗滌3次，每次5 min。2%即用型山羊血清封閉1 h，直接滴加一抗（Anti-Pax7, 1﹕300；Anti-MyoD, 1﹕200）覆蓋孔底，4 ℃孵育過夜。移除一抗后用蒸餾水清洗，加入熒光二抗（羊抗鼠，1﹕100），室溫避光孵育1 h。吸去二抗后每孔滴加250 μL DAPI染液，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 骨骼肌衛星細胞生長曲線

取生長狀態良好的P3代衛星細胞，0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，以1×104個/孔接種于24孔細胞培養板。每天取3孔細胞消化，血球計數板計數，連續8 d，以培養時間為X軸，細胞密度為Y軸，繪制細胞生長曲線。

1.6 骨骼肌衛星細胞成肌誘導及鑒定

選P3代骨骼肌衛星細胞接種于6孔板，待細胞生長至80%—90%匯合時，改用成肌分化培養基（2% HS+1%雙抗+DMEM高糖培養基）繼續培養。隔2 d換一次液，觀察細胞生長狀況和肌管融合情況。

連續誘導8 d，視野中看到大量細胞融合時進行細胞免疫熒光染色。經固定、通透、封閉后，加入一抗（Anti-MHC, 1﹕200）4 ℃過夜，第二天加入熒光二抗避光孵育1 h。滴加DAPI染液后，熒光顯微鏡觀察。

1.7 骨骼肌衛星細胞成脂誘導及鑒定

取P3代骨骼肌衛星細胞接種于6孔板，當細胞培養至80%融合時，更換完全培養基為成脂誘導分化液（10% FBS+5 μg·mL-1胰島素+1 μmol·L-1DEX +0.5 mmol·L-1IBMX +1μmol·L-1羅格列酮+1%雙抗+DMEM高糖培養基）誘導3 d，之后改用成脂誘導維持液（10% FBS+5 μg·mL-1胰島素+1%雙抗+DMEM高糖培養基）維持9 d。每隔3 d更換新鮮誘導維持培養液。

油紅O染色鑒定細胞成脂分化能力。PBS緩沖液漂洗細胞3次，用4%多聚甲醛室溫固定10 min，棄去并加入新多聚甲醛再次固定1 h。蒸餾水沖洗3次，加入60%異丙醇靜置5 min，開蓋完全干燥。加入1 mL油紅O染液（油紅O儲液﹕蒸餾水=3﹕2），37 ℃染色30—40 min，棄去油紅O染液，蒸餾水洗滌4次，顯微鏡下觀察染色結果。

油紅O定量檢測，每孔加2 mL異丙醇萃取脂滴，37 ℃恒溫搖床孵育15 min，酶標儀檢測510 nm處OD值。

1.8 骨骼肌衛星細胞成骨誘導及鑒定

取P3代骨骼肌衛星細胞接種于6孔板，細胞密度達到90%后誘導成骨。成骨誘導培養液（10% FBS+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+0.1 μmol·L-1DEX+50 mg·L-1抗壞血酸+1%雙抗+DMEM高糖培養基）培養3周，期間每3 d換一次液，觀察細胞形態變化。

對誘導細胞茜素紅染色。多聚甲醛固定15 min，棄去固定液后蒸餾水洗3次，待液體完全吸干凈后加入茜素紅染色液，室溫染色30 min。棄去染液加蒸餾水保持濕潤，顯微鏡下觀察。

1.9 RNA提取及相關基因qRT-PCR檢測

成肌誘導組（收集0 d、誘導2、4、6、8 d細胞）、成脂誘導組（收集0 d、誘導3、6、9、12d細胞）、成骨誘導組（收集0 d、誘導7、14、21 d細胞）分別提取細胞RNA，并按照說明書要求反轉錄。采用qRT-PCR的方法分別檢測成肌誘導、成脂誘導、成骨誘導后相關基因的相對表達量，以18S為內參基因，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.10 數據分析

所有試驗均設置3個生物學重復，數據結果使用SPSS Statistics 21.0軟件單因素方差分析進行顯著性檢驗，不同時間點標志基因表達量的差異采用Duncan’s法進行多重比較，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 骨骼肌衛星細胞形態學觀察

分離的原代骨骼肌衛星細胞接種至培養皿2 h后，其中的成纖維細胞、血細胞等雜細胞已貼壁。倒置顯微鏡下觀察，剛分離出來的衛星細胞呈球形，折光性強（圖1-A）。此時，轉移細胞懸液到新培養皿中，對骨骼肌衛星細胞進行第一次純化。18 h后再次轉移上清液，衛星細胞的純度再次提升。多次純化后，觀察發現部分衛星細胞貼壁并向四周延展，部分細胞周圍有小的突起（圖1-B）。繼續培養24 h，大多數衛星細胞已貼壁，細胞呈梭形或紡錘形，細胞飽滿且折光性較強（圖1-C）。首次更換新鮮培養基后，可見衛星細胞數量明顯增多，且細胞形態也變得多樣，相鄰衛星細胞開始相互接觸（圖1-D）。

當衛星細胞生長達70%時，可按照1﹕1的比例傳代培養或凍存（圖1-E）。由于細胞增殖能力不斷增強，細胞逐漸拉長變細形成有規律的平行排列（圖1-F）。繼續培養可見細胞方向性排列更明顯，并能自發融合形成多核肌管（圖1-G）。復蘇后的骨骼肌衛星細胞與凍存前形態相似，細胞生長狀態良好且增殖能力較強，表明試驗所用的凍存體系可用來保存骨骼肌衛星細胞（圖1-H）。

2.2 骨骼肌衛星細胞免疫熒光鑒定

應用細胞免疫熒光技術檢測P2代骨骼肌衛星細胞蛋白Pax7、MyoD的表達情況，并用DAPI染核。結果發現，Pax7和MyoD均呈陽性表達（圖2-A、2-D），經DAPI染色后細胞核呈藍色（圖2-B、2-E）。其中，Pax7熒光強度較強，表明其在細胞內的表達量可能較高（圖2-C），MyoD熒光強度較弱，說明其在細胞中表達量可能較低（圖2-F），綜上確證本次試驗成功分離了骨骼肌衛星細胞，且細胞純度較高。

2.3 骨骼肌衛星細胞生長曲線

骨骼肌衛星細胞生長曲線呈“S”型。體外培養骨骼肌衛星細胞前2 d生長較緩慢，為潛伏期。3—5 d細胞開始迅速增殖，進入指數生長期。此后由于細胞密度增大，細胞相互接觸造成生長減慢，達到平臺期。

A：剛分離的骨骼肌衛星細胞呈球形，折光性強；B：部分衛星細胞開始細胞貼壁，向四周延展；C：分離培養48 h衛星細胞呈梭形或紡錘形；D：分離培養72 h衛星細胞數量增加出現匯合；E：細胞生長至70%時的形態；F：培養5 d細胞拉長變細呈有規律排列；G：培養7 d衛星細胞自發融合，形成多核肌管；H：復蘇第3次傳代后凍存的骨骼肌衛星細胞

A：Pax7呈陽性表達；B：DAPI染色細胞核；C：A與B疊加圖片；D：MyoD呈陽性表達；E：DAPI染色細胞核；F：D與E疊加圖片

2.4 骨骼肌衛星細胞成肌誘導

利用2% HS對骨骼肌衛星細胞誘導成肌分化，加入誘導成肌分化液48 h后可見細胞融合并出現少量短粗肌管（圖4-A）。隨后，細胞融合更加廣泛，形成大量多核肌管（圖4-B）。繼續誘導至4 d，顯微鏡下觀察可見肌管相互融合，且肌管之間平行排列（圖4-C）。MHC細胞免疫熒光結果為陽性（圖4-D），DAPI染色可見肌管內存在多個細胞核（圖4-E），表明本試驗衛星細胞成肌誘導成功（圖4-F）。

對誘導0、2、4、6、8 d細胞進行qRT-PCR檢測，結果顯示標志基因和在誘導的各階段均有表達（圖5）。在成肌誘導分化過程中二者均呈先升高后下降趨勢，都在第4天達到最大值，且極顯著高于誘導0 d（＜0.01）。

圖3 骨骼肌衛星細胞生長曲線

A：誘導48 h，衛星細胞融合出現少量肌管；B：誘導72 h，肌管數量增多；C：誘導4 d后，肌管之間相互融合；D：分化后MHC免疫熒光；E：DAPI染核；F：D和E疊加

不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。下同

2.5 骨骼肌衛星細胞成脂誘導

選取P2代細胞誘導成脂分化72 h后發現，細胞形態由梭形變為三角形或多邊形（圖6-A）。誘導6 d，顯微鏡下可見細胞質逐漸透亮，有少量脂滴出現（圖6-B）。繼續誘導至9 d，可見細胞逐漸變圓，體積增大，脂滴數量明顯增多（圖6-C）。隨著時間的延長，誘導12 d后，脂滴聚集融合形成大脂滴（圖6-D）。用油紅O分別對誘導3、6、9和12 d的衛星細胞染色，結果可見大小不等的紅色葡萄樣脂滴（圖6-E—H），肉眼觀察培養板底部也出現紅色沉淀（圖6-I—L）。

A-D：分別為成脂誘導3、6、9、12 d衛星細胞形態學觀察（100×）；E-H：誘導細胞油紅O染色，脂滴呈紅色（100×）；I-L：肉眼觀察誘導后培養皿底可見紅色沉淀

油紅O定量檢測結果表明，隨著成脂誘導的推進，甘油三酯含量呈穩步上升趨勢，誘導3 d表達量最低，12 d后含量最高，且各時間點均存在極顯著差異（＜0.01）。結合油紅O染色及定量結果，表明衛星細胞成脂誘導分化成功（圖7）。

檢測、、和的表達情況，結果如圖8所示，分化各時間點與0 d相比差異極顯著（＜0.01）。其中表達量隨著誘導分化時間的推進，該基因表達量前期逐步上升并保持穩定。主要在分化中期表達，表達量呈先升高后下降趨勢。和表達情況相似，第3天達到最高，隨后逐漸下降。

2.6 骨骼肌衛星細胞成骨誘導

在成骨誘導培養基中培養7 d后，衛星細胞逐漸收縮變為不規則形態（圖9-A）。誘導14 d后，細胞部分復層生長，細胞間可見鈣化沉淀（圖9-B）。繼續誘導至21 d，細胞立體感增強，出現大量礦化結節（圖9-C）。茜素紅染色可見隨著分化時間的延長，呈圓形不透明的鈣化結節數量和密度都明顯增加（圖9-D—E）。染色后培養皿底部也出現了顆粒狀沉淀，進一步表明成骨誘導成功（圖9-F—G）。

圖7 油紅O定量結果

圖8 成脂誘導分化后PPARγ、CEBP/β、FABP4和HSL表達情況

A-C：成骨誘導7、14、21 d衛星細胞顯微鏡下觀察（100×）；D-F：茜素紅可將誘導后細胞形成的鈣化結節染成紅色（100×）；G-I：肉眼觀察誘導后皿底出現紅色沉淀結節

Fig .9 Osteogenic differentiation of skeletal muscle satellite cells and Alizarin Red staining

誘導骨骼肌衛星細胞成骨分化，檢測成骨基因骨鈣素（）和Runt相關轉錄因子2（）的表達情況，如圖10所示。誘導成骨分化過程中，成骨標志基因的表達水平均上調，都在第3周達到最高，與0 d相比差異極顯著（＜0.01）。

圖10 成骨誘導后BGLAP和RUNX2表達情況

3 討論

骨骼肌衛星細胞作為靜息狀態的肌源性干細胞，參與骨骼肌的生長與修復過程，對維持機體穩態具有重要作用[30]。骨骼肌衛星細胞分離培養的關鍵在于使數量較多且活力較好的衛星細胞釋放，因此有學者對衛星細胞的純化方式進行了改進。單根肌纖維法是將完整的肌纖維從肌束中剝離，從而使衛星細胞游離出來的一種方法[31]。但該方法分離衛星細胞所需時間較長且獲得細胞數量有限，因而應用受限。鑒于骨骼肌衛星細胞存在于基膜與肌纖維之間，只有基膜分解才有助于衛星細胞的獲取[32]，因此如今體外分離衛星細胞常用酶消化法。傳統的單一酶消化法不能完全解離衛星細胞，選用膠原酶胰酶的兩步酶消化法可彌補先前缺點，保證衛星細胞的產出率[33]。運用酶消化法很難避免成纖維細胞的出現，可通過純化的方式提高衛星細胞的純度。其中流式分選術用于人和小鼠等模式動物細胞分選較多，但基于設備的限制及細胞表面特異分子標志價格昂貴，并未在家養動物中推廣。Percoll梯度密度離心法步驟繁瑣、易污染，多次離心后會導致細胞流失。差速貼壁法是根據衛星細胞與雜細胞粘附時間上的差異，成纖維細胞貼壁速度快，通過多次差速得到純度較高的衛星細胞，此法簡單易行且對細胞無損傷[34]。

本試驗選用Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶聯合消化法分離骨骼肌衛星細胞，并對消化時間進行嚴格控制。剛分離出的骨骼肌衛星細胞呈圓形，通過反復差速貼壁兩次以逐步去除成纖維細胞、血細胞等雜細胞，實現對衛星細胞的純化。重新接種6 h后，部分衛星細胞開始貼壁延展，繼續培養24 h，細胞呈現長梭形或紡錘形，接種3 d可見貼壁細胞數量明顯增多，部分細胞出現匯合。接種5 d后，細胞密度達到90%，此時細胞呈有規律的方向性生長，繼續培養則衛星細胞出現自融合現象，臨近細胞會融合成肌管。分離純化結果與Baquero等研究結果基本一致[35-36]。

目前對骨骼肌衛星細胞的鑒定有多種方法，其中公認度最高的是免疫細胞化學染色法，該法原理就是抗原抗體反應，因靈敏度高、特異性強等優點被廣泛使用[37]。已有報道證實95%以上的衛星細胞都表達，此外還能調控衛星細胞處于靜息或激活狀態，因此可作為鑒定骨骼肌衛星細胞的標志物[38]。本試驗參考FENG等[39]的方法，通過細胞免疫熒光法對衛星細胞特異性基因、的蛋白表達情況進行檢測，結果可見標志物染色呈陽性，且陽性細胞多，表明分離培養的衛星細胞純度高、活性好。

骨骼肌衛星細胞對培養要求較高，大量的研究結果表明，衛星細胞的體外培養需要添加合適濃度的血清，高濃度的血清有助于細胞增殖，血清濃度的降低會促進衛星細胞的分化。STARKEY的研究發現，低血清濃度可使衛星細胞自發向成肌細胞方向分化，但并不能自行分化為脂肪細胞、骨細胞等非成肌細胞[40]。已有的研究結果證實，在添加堿性成纖維細胞生長因子的培養基中，有利于衛星細胞的增殖[41]。本試驗最終選擇在高糖培養基中添加10%濃度胎牛血清來培養骨骼肌衛星細胞，當細胞增殖匯合到一定密度后，即使高濃度血清培養細胞也會出現不可逆分化，最終融合成肌管的現象，因此衛星細胞的傳代應選擇細胞密度70%左右時進行。本試驗結合之前方法用2%馬血清誘導衛星細胞分化，結果顯示誘導4 d可見大量較長較粗肌管形成，MHC染色呈陽性，進一步確證骨骼肌衛星細胞的成肌分化。

在模式動物中的研究中，已證實體外培養的小鼠衛星細胞可直接分化成脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞等[42]。目前，對豬骨骼肌衛星細胞多向分化潛能的研究較少。本試驗參考“激素雞尾酒”法對衛星細胞誘導成脂，在添加胰島素、地塞米松、IBMX和羅格列酮等誘導因子條件下培養衛星細胞[43]。對細胞成脂能力的鑒定主要選用油紅O染色，油紅O染色呈陽性可作為脂滴沉積的標志[44]。結果發現誘導3 d衛星細胞形態發生變化，此后更換為維持培養基繼續誘導可見大量脂滴出現，油紅O染色及定量結果都表明成脂誘導成功。對于骨骼肌衛星細胞成骨誘導，多在培養基中補充β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和地塞米松來促進鈣質形成，誘導結節鈣化[45]。利用茜素紅可與鈣發生顯色反應的特性，可結合染色結果判定細胞成骨礦化結節積累情況，進而鑒定細胞成骨分化效果[46]。本試驗結果表明誘導衛星細胞成骨分化后，茜素紅染色可見大量骨鈣結節形成，同時熒光定量結果顯示誘導成骨成功，這與REN等[47]在山羊上的研究結果相似。

眾所周知，骨骼肌衛星細胞作為機體干細胞的一種，具有可塑性強、多潛能等優點[48]。衛星細胞體外分離培養體系的建立，可為豬骨骼肌生長發育、肉質改良提供研究基礎。同時為畜禽遺傳資源保存提供了新方法，也為今后基因組學研究提供相應的實驗材料。此外本試驗還證明了豬骨骼肌衛星細胞的多向分化潛能，拓寬了衛星細胞在組織工程和再生醫學上的研究價值和廣泛的應用前景。

4 結論

本試驗成功分離豬骨骼肌衛星細胞，通過細胞免疫熒光檢測骨骼肌衛星細胞標志蛋白對其進行了鑒定。建立了豬骨骼肌衛星細胞體外分離、純化以及鑒定的方法，同時利用不同誘導劑分別對其誘導成肌、成脂、成骨，探索了骨骼肌衛星細胞的生物學特性。對研究豬肌肉生長發育過程具有一定科學意義，也為后續探究豬肌肉衛星細胞功能和分子機制提供了試驗材料。

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Isolation, Culture, Identification and Biological Characteristics of Pig Skeletal Muscle Satellite Cells

QIN BenYuan, YANG Yang, ZHANG YanWei, LIU Min, ZHANG WanFeng, WANG HaiZhen, WU YiQi, ZHANG XueLian, CAI ChunBo, GAO PengFei, GUO XiaoHong, LI BuGao, CAO GuoQing

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi)

【Objective】 The aim of this study was to establish a method for isolation, purification and identification of porcine skeletal muscle satellite cells in vitro, and to explore its biological characteristics, in order to provide a reliable cell model for further research of muscle growth and development in pigs. 【Method】In this study, themuscle of 1 day old pig was selected and cut into meat emulsion in aseptic state. After that, it was digested with 0.2% type I collagenase for 90 min, and then digested with 0.25% trypsin for 30 min at 37 ℃. After termination of digestion, filtration and resuspension, the isolated cells were cultured in a 37 ℃ and 5% CO2cell incubator. The skeletal muscle satellite cells were purified by repeated differential adherence technique. The first purification selection was performed after cell culturing for 2 h, and non-adherent cells were transferred to a new culture dish. After the supernatant was further cultured for 18 h, the satellite cells were purified again. The cells were subcultured or frozen when the cell density reached 70% - 80%. Cell immunofluorescence technique was used to detect the protein expression of marker genes ofandof P2 satellite cell, and the growth curve was determined. The satellite cells were differentiated into myocytes, adipocytes and osteoblasts by adding different inducing differentiation fluids. The protein expression of myoblast differentiation marker genewas detected by using cell immunofluorescence to identify myotube formation in satellite cells. Oil red O staining and triglyceride content were quantified to identify the adipogenic differentiation effect in satellite cells. Alizarin red staining was used to identify the osteogenic differentiation ability in satellite cells, which were detected the expression of key genes during myogenesis, adipogenesis and osteogenesis by qRT-PCR. 【Result】 The results showed that the satellite cells with higher purity were isolated and purified by two-step enzymatic digestion and repeated differential adherence technique. The cells that were originally isolated with highly refractive, and were fusiform or spindle-shaped after adherence, after which the cells extended and began to proliferate. The results of cell immunofluorescence identification of satellite cells specific marker proteins Pax7 and MyoD were positive, indicating that the isolated cells were skeletal muscle satellite cells. Skeletal muscle satellite cell proliferation underwent the incubation period, and the growth period and finally reached the plateau phase. The satellite cells were self-fusion when the cells grew to 90% density. After myogenic induction and differentiation of the satellite cells, a large number of myotubes were formed by the adjacent satellite cells. Multinucleated myotubes were regularly arranged and the myoblast marker protein MHC staining was positive. The qRT-PCR results showed that the marker genes ofandboth increased first and then decreased during the process of myoblast differentiation. After adipogenic induction, the cell morphology changed into triangle, and lipid droplets appeared and aggregated into large lipid droplets with continuous induction. Oil red O staining observed a large number of red grape-like lipid droplets. Oil red O staining quantitative results showed that the triglyceride content steadily increasing during the adipogensis. There were extremely significant differences among each time point (＜0.01). The qRT-PCR results showed that the expression level ofgene was high in the middle and the late stage of induction. Thegene reached the highest at the 6th day of induction and was significantly higher than that at other time points (＜0.01). A similar dynamic was observed with the relative expression level ofandin the differentiating cells. Their expression tended to increase first and then decrease. After inducing osteogenic differentiation, it was found that the cell morphology became irregular. Cells formed bone nodules after inducing, compared with the period without induction, the alizarin red staining showed that the number and density of round opaque calcified nodules were significantly increased. The results showed that the cells appeared osteogenic differentiation. The expression levels of osteogenic marker genesandalso showed a steady upward trend during the inducing procession, which was significantly different from that without inducing cells (＜0.01). 【Conclusion】 This study established a method for isolation and purification of pig skeletal muscle satellite cells based on combined enzyme digestion and differential adherent technique. The obtained cells had strong proliferation ability and multi-directional differentiation potential. The results provided a technical platform for pig skeletal muscle satellite cells as seed cells for future tissue engineering research.

pig; satellite cell; isolation culture; identification; differentiation

2019-09-29；

2020-01-13

國家自然科學基金（31872336）、三晉學者支持計劃專項經費資助（2016；2017）、山西省“1331”工程資助、山西省農業重點研發項目（201803D221022-1）、山西農業大學畜牧學學科建設專項課題資助

秦本源，Tel：18503442342；E-mail：923726358@qq.com。楊陽，Tel：13007050956；E-mail：yangyangh@163.com。秦本源與楊陽為同等貢獻作者。通信作者曹果清，Tel：13403665105；E-mail：anniecao710502@ aliyun.com

（責任編輯 林鑒非）