苯磺隆脅迫下甘藍型油菜萌發期關聯性狀的QTL定位及候選基因篩選

王劉艷，王瑞莉，葉桑，郜歡歡，雷維，陳柳依，吳家怡，孟麗姣，袁芳，唐章林，李加納，周清元，崔翠

苯磺隆脅迫下甘藍型油菜萌發期關聯性狀的QTL定位及候選基因篩選

王劉艷，王瑞莉，葉桑，郜歡歡，雷維，陳柳依，吳家怡，孟麗姣，袁芳，唐章林，李加納，周清元，崔翠

（西南大學農學與生物科技學院，重慶 400716）

【目的】尋找苯磺隆脅迫下油菜種子萌發性狀相關的QTL及其耐性基因，為篩選與培育耐苯磺隆油菜種質以及探究油菜種子萌發過程中苯磺隆耐性分子機理奠定基礎。【方法】用0.15 mg·kg-1苯磺隆溶液處理由人工合成甘藍型油菜10D130和甘藍型油菜常規品種ZS11構建的包含175個株系的高世代重組自交系（RIL）群體，進行種子發芽試驗，以蒸餾水為對照，分別測定其相對發芽勢、相對發芽率、相對根長和相對干重。然后，利用油菜6K SNP芯片對該RIL群體進行基因分型，通過JoinMap4.0軟件構建高密度遺傳連鎖圖譜。基于該遺傳圖譜，利用MapQTL軟件多QTL作圖法對4個性狀的相對值進行QTL定位，根據各QTL置信區間查找甘藍型油菜的基因序列，并依次與擬南芥基因組序列進行BLAST，篩選可能與耐苯磺隆脅迫相關的候選基因。【結果】頻數分布表明4個相對性狀的變異范圍較大，且呈連續性分布，符合數量性狀表現特征，適宜進行QTL遺傳分析。相關分析表明，相對發芽率和相對發芽勢呈極顯著正相關，相關系數為0.587。構建的遺傳圖譜包含1 897個多態性SNP標記，覆蓋甘藍型油菜基因組3 214.19 cM，標記之間的平均圖距為1.69 cM。利用此圖譜共檢測到22個相關QTL，表型貢獻率變幅為6.4%—12.6%。其中，與相對發芽勢、相對發芽率相關的QTL分別有6個和3個，與相對根長和相對干重有關的QTL分別為8個和5個。在A01染色體64.857 cM、55.935 cM和56.645 cM處檢測到的相對發芽勢與相對發芽率QTL的置信區間完全或者部分重疊。通過分析QTL置信區間上甘藍型油菜對應的區間序列，篩選到30個可能與油菜耐苯磺隆有關的候選基因，其中包括18個細胞色素P450家族成員、5個糖基轉移酶家族基因、1個GSTF相關基因、1個ABC轉運蛋白相關基因和1個ALS基因，這些基因均與除草劑抗性機制有關，尤其ALS為磺酰脲類除草劑靶位點酶；另外篩選到1個BHLH和1個JAZ6基因，BHLH與JAZ蛋白可通過相互作用來防御脅迫；檢測到1個LSU2蛋白相關基因和1個MATE家族成員，前者參與細胞氧化劑解毒及植物防御反應，后者參與類黃酮、生物堿、金屬離子、其他多種代謝物的轉運及有毒物質引起的植物脅迫響應。【結論】檢測到與相關QTL共22個，篩選出可能與苯磺隆耐性有關的候選基因30個。這些基因通過加速毒性分子的轉運與代謝從而響應有毒物質引起的脅迫反應，可能參與植物對苯磺隆的抗性調節與反應機制。

苯磺隆；甘藍型油菜；萌發期；QTL；候選基因

0 引言

【研究意義】草害是影響作物產量的一個重要因素[1]，苯磺隆（tribenuron-methyl，TBM)作為一種磺酰脲類乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制類闊葉類雜草除草劑[2]，通過抑制ALS活性從而影響異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸生物合成[3]。甘藍型油菜（L.）是闊葉類作物，對苯磺隆較敏感。一定濃度苯磺隆可誘導油菜雄性不育[4]，甚至會造成油菜發育遲緩、葉片和花瓣褪色、開花時間縮短[5]，因此，目前在油菜生產上較少直接使用苯磺隆化學除草[6]。雖然苯磺隆多用于麥田闊葉類雜草防除[7]，但是輪作、間作或套作等種植方式導致苯磺隆土壤殘留或者農藥飄移[8]，對油菜種子萌發及油菜生產造成重要影響。萌發期作為油菜生長發育的起始階段，也是作物生長的關鍵階段，對外界脅迫較敏感[9]。已有研究表明，在萌發期進行磺酰脲類除草劑脅迫處理可以成功篩選出耐性種質[10-11]，減少苯磺隆對油菜生產的影響。因此，對苯磺隆脅迫下油菜萌發期相關性狀進行QTL定位，并挖掘相關基因，有助于了解油菜對苯磺隆脅迫的響應機制，對篩選和培育耐苯磺隆油菜品種具有重要的理論與現實意義。【前人研究進展】分子標記方法廣泛應用于數量性狀基因相關研究，將單個QTL定位到染色體上，并估計出單個數量性狀基因的遺傳效應[12]。近年來，針對逆境脅迫下油菜耐性的QTL定位取得了重要進展，為研究不同逆境脅迫下油菜響應的分子機制奠定基礎。Li等[13]利用SSR和AFLP標記繪制遺傳圖譜，采用復合區間作圖法對澇、旱環境下油菜幼苗的5個性狀進行QTL分析，檢測到與水澇脅迫有關的26個QTL，31個與干旱脅迫有關的QTL。Basnet等[14]使用包括435個SSR、AFLP等標記的遺傳圖譜，對鹽脅迫下油菜種子萌發相關性狀進行QTL分析，在10個連鎖群中共鑒定到26個QTL。Lang等[15]根據173個SSR標記和30個AFLP標記繪制了一張覆蓋甘藍型油菜19個連鎖群的遺傳圖譜，并對鹽脅迫下甘藍型油菜幼苗期的10個指標進行分析，共檢測到45個QTL，并初步鑒定到耐鹽相關基因。SNP具有標記多、構建的連鎖圖譜密度大等優勢[16]，現已逐漸取代SSR及AFLP等傳統標記技術，在農作物中發揮著越來越重要的作用[17]。Liu等[18]利用90K SNP繪制的遺傳圖譜，對熱、旱脅迫下小麥的株高、抽穗期和千粒重等7個表型進行QTL分析，共檢測到71個相關QTL。薦紅舉等[16]利用包含2 795個SNP的遺傳圖譜[19]，采用復合區間作圖法，分析鹽、干旱2種脅迫條件下甘藍型油菜種子發芽率的QTL，結果共檢測到11個與鹽脅迫相關的QTL，8個與干旱脅迫相關的QTL。侯林濤等[20]根據高密度SNP遺傳連鎖圖譜，對鹽脅迫下RIL群體的根、葉、干重及鮮重進行QTL定位，共檢測到19個QTL，其中6個與鹽脅迫相關，并找到8個與鹽脅迫相關的候選基因。關于苯磺隆對作物的影響方面，Liu等[21]對苯磺隆處理過的鵝腸菜（L.）進行轉錄組分析，發現、、和在苯磺隆的代謝抗性中發揮重要作用。周清元等[6]運用全基因組關聯分析對苯磺隆脅迫下的241份甘藍型油菜萌發期相關性狀的遺傳機制進行探究，篩選出25個可能與油菜耐苯磺隆有關的候選基因。吳學莉等[22]將一個從抗苯磺隆播娘蒿的天然突變體中克隆到的ALS基因轉入甘藍型油菜，結果顯示轉基因油菜對苯磺隆的抗性提高至野生型致死濃度的3倍。胡茂龍等[23]研究發現，一種抗苯磺隆油菜突變體M9的抗性是由的單堿基突變所致。孫妍妍等[7]用苯磺隆處理經EMS誘變的甘藍型油菜，成功篩選到3株抗苯磺隆突變體，并克隆到相應的突變基因。【本研究切入點】盡管前人利用全基因組關聯分析[6]、轉基因[22-23]、化學誘變[7]等方法找到苯磺隆抗性基因，但是利用SNP構建連鎖遺傳圖譜來定位苯磺隆脅迫下萌發期相關性狀QTL，迄今未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究對重組自交系群體中175個株系進行萌發期耐苯磺隆特性鑒定，并借助由6K SNP芯片構建的連鎖遺傳圖譜分別對相對發芽勢、相對發芽率、相對根長和相對干重進行QTL定位，根據位點置信區間內序列預測可能與苯磺隆耐性相關的基因，以期為篩選培育苯磺隆耐性種質以及進一步探究油菜耐苯磺隆的機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為175個株系組成的重組自交系群體，該群體來自于10D130×中雙11（記作：ZS11）雜交組合，通過單粒法自交7代獲得F2:7群體。其中，ZS11是中國農業科學院油料所選育的常規優質油菜品種；10D130是從芥菜型油菜和羽衣甘藍種間雜種后代中選育的高世代自交系[24]。2017—2018年在重慶市北碚區歇馬鎮油菜試驗基地種植親本10D130、ZS11及重組自交系群體，初花期分別套袋自交，待種子成熟時進行收獲，自然風干后保存備用。苯磺隆為沈陽市和田化工有限公司生產的“麥發”苯磺隆。10D130、ZS11和重組自交系群體均由西南大學油菜工程技術研究中心提供。

1.2 苯磺隆脅迫濃度篩選

從10D130和ZS11中選擇飽滿的種子，分別擺放在鋪有2張濾紙的培養皿上，每皿20粒，添加3 mL不同濃度（0（CK）、0.075、0.15、0.25和0.50 mg·kg-1）的苯磺隆溶液，每個處理設3次重復（3皿）。將培養皿放在25℃、相對濕度為85%、光照和黑暗時間為16 h/8 h的恒溫光照培養箱中。參考郜歡歡等[25]的方法，在脅迫處理7 d后，每皿隨機挑選10株長勢基本一致的幼苗，用于測量根長，根據根長平均值篩選出適宜的處理濃度。

1.3 種子萌發試驗與性狀調查

以篩選出的適宜濃度的苯磺隆溶液處理重組自交系群體種子（蒸餾水作對照），處理與對照均設置3次重復；在第5天移除培養皿蓋子，每天根據培養皿的干濕情況補充相同體積的各濃度溶液。處理后第3天統計發芽勢，第7天統計發芽率；處理7 d后，每皿隨機挑選10株長勢基本一致的幼苗用于測量根長，然后將這10株幼苗于105℃殺青10 min，75℃烘干24 h后測量干重。種子選擇標準和恒溫培養箱環境設置均同1.2。參考王倩等[11]方法，計算相對發芽勢（relative germination vigor，RGV）、相對發芽率（relative germination rate，RGR）、相對根長（relative root length，RRL）和相對干重（relative dry weight，RDW）值。

1.4 數據處理

采用Excel 2010對數據進行整理，并繪制萌發期4個相對性狀的分布直方圖；利用DPS 9.0對濃度篩選試驗數據進行顯著性分析；通過SPSS 22統計軟件對數據進行描述性統計及相關性分析。

物理化學監測是通過定期定點采樣來監測水體的物理、化學性質。根據水體實際情況，設置若干個監測點，包括地表水和地下水。汛期每月采樣一次，大雨后加測，非汛期每季度采樣一次。地表水測定項目包括水溫、溶解氧（DO）、總氮（TN）、總磷（TP）、高錳酸鉀指數（CODMn）、五日生化需氧量（BOD5）、懸浮物（SS）等；地下水測定項目包括色度、溶解性總固體、總硬度和硝酸鹽。

LSX-213 Nd∶YAG激光剝蝕系統(美國Cetac公司)；7700型電感耦合等離子質譜儀(美國Agilent公司)。

1.5 遺傳連鎖圖譜構建及QTL分析

參考劉列釗等[19]方法，分別從每個株系的5個幼嫩植株葉片取混合樣0.15 g，采用DNA提取試劑盒DP321-03（天根，中國北京）提取DNA并稀釋至50 ng·μl-1用于SNP標記分析。嚴格按照Infinium HD Assay Ultra操作說明書（Illumina Inc公司）進行DNA樣品的預處理（等位擴增、片段化及富集）、與芯片雜交、洗滌、安裝流動室、單堿基延伸、染色及包埋。芯片準備好后運用Illumina HiScan掃描儀的iScan Control Software軟件掃描，然后利用GenomeStudio genotyping software v2011軟件分析掃描結果，獲取各樣本的SNP基因型數據，并為獲得的SNP標記命名，命名方法以AX-95505568為例，95505568代表GenomeStudio genotyping software生成的相應SNP位點索引號。

根據已經公布的甘藍型油菜基因組測序結果，將22個QTL置信區間內的甘藍型油菜序列和擬南芥的序列進行比對，篩選到30個可能與苯磺隆耐性有關的候選基因（表6）。其中，共有18個細胞色素P450基因家族成員和5個糖基轉移酶相關基因（glycosyl transferase，GT）、1個谷胱甘肽轉移酶（glutathione- s-transferase，GST）相關基因、1個ALS相關基因、1個為ABC（ATP-binding cassette）家族蛋白基因、1個螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，BHLH）轉錄因子、1個茉莉酸酯結構域蛋白6（jasmonate-zim- domain protein 6，JAZ6）、1個LSU2（response to low sulfur 2）和1個MATE efflux家族成員。

連鎖圖譜的構建采用JoinMap4.0軟件，選用Kosambi[26]函數將重組值轉換為圖距單位（centiMorgan，cM），取最小閥值LOD2.0對所有標記進行分組，每個染色體上標記順序通過兩兩標記之間最小重組頻率計算，構建用于QTL定位的遺傳連鎖圖譜。

利用包含5 058個標記的6K SNP芯片對186個RIL材料進行基因型鑒定，從中篩選出1 897個高質量多態性的SNP標記，約占37.5%，基于這些標記構建遺傳連鎖圖譜。獲得用于QTL定位的圖譜覆蓋甘藍型油菜基因組3 214.19 cM，平均圖距為1.69 cM。每條染色體長度范圍為86.51—298.72 cM，平均長度為169.17 cM。染色體標記數目在24—153，平均數目為99.84個。但是從標記分布來看，各染色體分布不均，其中，染色體A03、C03和C04上標記分布較多，分別為139、147和153個；而染色體C05、C08和C09上的標記數目較少，分別只有48、26和24個。此外各染色體標記密度也有較大差異，C04密度最大，平均間距僅1.10 cM，而密度最小的C08平均間距達6.13 cM。

在脅迫處理下，ZS11的相對發芽勢、相對發芽率、相對根長和相對干重4個性狀的均值高于10D130（表2），表明ZS11較10D130表現出更強的耐性。用0.15mg·kg-1苯磺隆溶液處理重組自交系群體（F2:7群體），結果（表2）表明，4個相對性狀變異系數為13.5%—36.0%，說明群體內各株系間呈廣泛的遺傳變異。對175份材料重復間及株系間進行單因素方差分析（表3），發現重復間無顯著性差異（＞0.05），而株系間差異顯著（＜0.05）。對4個相對性狀進行頻次分布作圖（圖1），結果顯示，4個相對性狀在重組自交系群體中呈連續性分布，且雙向超親分離，符合數量性狀表現特征，適宜進行QTL遺傳分析。4個相對性狀的相關性分析如表4，其中，相對發芽率和相對發芽勢相關系數為0.587，呈極顯著正相關（＜0.01），其余性狀兩兩之間相關系數介于-0.122—0.072，均未達到顯著水平（＞0.05）。

利用MapQTL軟件對相對發芽勢、相對發芽率、相對根長和相對干重4個性狀進行QTL檢測，檢測方法選擇MQM Mapping（多QTL作圖法）。當LOD≥2.5時，即認為該區間可能存在一個QTL。位點命名方式為：q加相對性狀的英文縮寫，再加染色體編號及QTL序號（如位于A01染色體上檢測到的第一個相對根長QTL位點，記作。采用MapChart 2.5繪制QTL定位遺傳連鎖圖。

選取目標樣品點的粒度參數：河流沉積物S介于0.260～0.380；海洋沉積物S介于-0.210～0.220；黃土沉積物S介于-0.490～-0.190；湖泊沉積物S介于-0.034～0.570；冰磧物S介于1.000～2.950；而漢源九襄地區沉積物S介于-0.0067～0.8000。從以上數據可以得知黃土沉積物S均為負，說明粒度主要為細粒。其中冰磧物S范圍最廣，且擁有最大S值。而冰水沉積物S和河流沉積物S總體起伏不大，且S值相近(見圖8)。

1.6 候選基因的篩選

根據QTL的置信區間查詢甘藍型油菜基因組（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/cgi-bin/gbrowse/colza/）對應的序列，然后與TAIR網站上（https:// www.arabidopsis.org/Blast/index.jsp）的擬南芥基因組序列進行BLAST，從E≥1×10-25的結果中篩選出可能與耐苯磺隆脅迫相關的基因[27]。

2 結果

2.1 苯磺隆脅迫濃度篩選

在低濃度下（0.075mg·kg-1），雖然ZS11根長較對照下降10.15%，10D130根長較對照下降15.78%，但是2份材料的處理組與對照組均無顯著性差異（＞0.05）（表1）；高濃度（≥0.25mg·kg-1）下，2個品種根長較對照下降均超過45%，處理組與對照組之間差異均呈顯著性（＜0.05）；在0.15mg·kg-1濃度下，ZS11根長較對照下降12.31%，與對照組之間差異不顯著（＞0.05），而10D130的根長較對照下降38.64%，與對照組差異顯著（＜0.05）,2個品種表現出明顯差異。過低和過高的苯磺隆脅迫濃度，盡管對2個品種均具有一定程度抑制作用，但是對2個品種間的區分度不明顯，而苯磺隆濃度為0.15mg·kg-1時能區分出兩親本對苯磺隆的耐性差異，因此，選擇0.15mg·kg-1作為重組自交系群體苯磺隆處理的適宜濃度。

表1 兩親本各濃度下根長顯著性分析

同一列不同字母表示處理間差異顯著（＜0.05） Different letters in the same column meant significant difference among treatments at 0.05 level

2.2 親本及F2:7群體表型性狀分析

我敢說：有了這樣的認識，這樣的追求，這樣的境界，這樣的人生定力，那么我們就可以做到：不管風吹浪打，勝似閑庭信步。我們就可以做到：金剛不敗，巍然屹立于世人群中。

2.3 遺傳連鎖圖譜

按照《中國多發性骨髓瘤診治指南》[7]，20例初發患者接受硼替佐米為基礎的化療方案；10例復發患者中，復發前接受硼替佐米(n=8)或沙利度胺(n=2)為基礎的方案，復發后接受硼替佐米(n=7)或來那度胺為基礎的方案(n=3)。另選擇行骨髓檢查的健康者20例為對照組，其中男性11例、女性9例，年齡40～70歲，中位年齡55歲，均排除近期感染、腫瘤、自身免疫性疾病或傳染性疾病。

表2 親本及F2:7群體4個相對性狀的表型分析

RGV：相對發芽勢；RGR：相對發芽勢；RRL：相對發芽勢；RDW：相對發芽勢。下同

RGV: relative germination vigor; RGR: relative germination rate; RRL: relative root length; RDW: relative dry weight.The same as below

表3 F2:7群體的重復間及株系間差異性分析

表4 F2:7群體4個性狀的相關性分析

**和*分別表示在0.01和0.05水平下顯著相關

** and * Stand for significant correlations at 0.01 and 0.05 probability levels, respectively

RGV：相對發芽勢；RGR：相對發芽勢；RRL：相對發芽勢；RDW：相對發芽勢。下同

2.4 F2:7群體4個相對性狀的QTL定位分析

2.4.2 相對根長與相對干重QTL 檢測到8個相對根長QTL，多數分布于A04和A06染色體上，少數位于A09和C01染色體上，表型貢獻率范圍為6.4%—12.6%。其中，在A04染色體上檢測到3個QTL，其中和為調控相對根長的主效QTL，表型貢獻率分別為12.6%和11.2%；在A06染色體上檢測到3個相對根長QTL，對應的置信區間在98.667—124.073 cM，可解釋表型率均較高；在A09和C01染色體上各檢測到1個與相對根長QTL，可解釋表型變異率為7.7%和6.4%。此外，檢測到5個與相對干重有關的QTL，表型貢獻率變幅為6.4%—8.1%。在A04染色體上檢測到2個QTL，其余3個QTL分別位于A02、A03和C03染色體上。其中具有最高表型貢獻率，為8.1%。

2.4.1 相對發芽勢與相對發芽率QTL 相對發芽勢共定位到6個QTL，分別位于A01、A06、C02、C03和C07染色體上（表5和圖2），可解釋的表型變異為6.6%—7.7%。其中，可解釋的表型最高，為7.7%，位于C02染色體上；表型貢獻率次之的是位于C03染色體上的，為7.3%。檢測到3個相對發芽率QTLs，可解釋的表型變異為7.2%—10.7%。其中，位于A01染色體上，可解釋表型變異為10.7%，為控制相對發芽率的主效QTL；和分別位于A01和A03染色體上，可解釋變異分別為7.5%和7.2%。此外，在A01染色體上位于64.857 cM的位置上同時檢測出相對發芽勢、相對發芽率相關的QTL位點。在A01染色體位于55.935 cM位置上存在相對發芽勢QTL，在該染色體56.645 cM位置上存在相對發芽率QTL，且兩者的置信區間幾乎重疊。

在A01染色體上檢測到的相對發芽勢與相對發芽率共同QTL（/）置信區間內篩選到1個未命名的候選基因，為MATE efflux家族成員，參與對有毒物質的響應。在的置信區間內篩選到一個蛋白，該蛋白參與細胞氧化解毒反應，對防御反應進行調節；在相對發芽率置信區間上找到1個ABC家族基因成員ABCI6，參與非生物脅迫響應。

圖2 甘藍型油菜4個相對性狀QTL在連鎖群上分布圖

表5 F2:7群體4個相對性狀的QTL定位

2.5 候選基因預測

潮州歷經時代的變遷，傳統文化的深刻積淀使潮人文化呈現出獨特的精神特質。潮人起源于中原，繁衍于潮汕而聞名海外，潮州因所處地域的優勢自古便是海上絲綢之路的重要節點，潮人與海外的經濟貿易、文化交流歷史悠久，至今東南亞、歐美等地均可見潮籍企業家的身影，“勇于開拓、誠實守信”是潮人精神的真實寫照，當前在各行業中均能找到潮人翹楚的印記。與潮人拼搏精神相輔相成的是潮人對故鄉潮州的感念之情，潮州是“海絲文化重鎮，潮人精神家園”，在潮籍學術大家的文學作品、書畫作品、影視作品中都能體味到濃郁的潮人情懷。例如漢學家饒宗頤，畫家林風俗、許欽松等名家都來自于潮州，通過他們所創作的作品可窺見作者對于家鄉的眷戀之情。

Python是一種解釋性語言，不需要編譯就可以直接運行，具有更強的移植性；在面向對象時，不再是功能的堆砌，而是由一系列相互作用的對象構建起來的。ESRI已正式將Python作為ArcGIS首選的腳本工具。

將相對根長QTL置信區間上的序列與擬南芥序列對比后，共篩選到20個與苯磺隆抗性相關的候選基因。在A04染色體上共找到5個候選基因，其中，有3個屬于GT成員（和），屬于GST家族蛋白，是細胞色素P450基因家族成員。在A06染色體上共找到14個候選基因，其中有13個細胞色素P450基因家族成員，1個ALS基因。在C01染色體上找到的，為細胞色素P450基因。

在相對干重QTL置信區間找到9個可能與耐性機制相關的候選基因。在A02、A03、C03染色體上各找到1個細胞色素P450基因家族成員，同時在A03、A04染色體上分別存在糖基轉移酶家族基因。另外，在A02染色體上檢測到的基因編碼JAZ6蛋白，編碼BHLH轉錄因子，均參與脅迫響應。

表6 苯磺隆耐性相關性狀的候選基因

3 討論

3.1 表型統計分析及QTL定位結果

對萌發期作物進行初步耐性鑒定，具有可操作性強、周期短、效率高等特點[28]。苯磺隆是一種闊葉類除草劑，一方面可以根據其化學殺雄作用[4]用于優勢雜種的配制；另一方面可以在播種或者移栽前與單子葉除草劑聯用，為油菜田日漸突出的闊葉類雜草防除問題[29]提供一種新思路。前人研究表明，0.075—0.1 mg·kg-1苯磺隆的化學殺雄效果最佳[30]，但是大于等于0.1 mg·kg-1后，植株停止生長，趨于死亡[22]。也有研究表明0.2 mg·kg-1苯磺隆將顯著降低油菜的ALS活性[31]，2.0 μg·mL-1苯磺隆適宜油菜篩選[32]。本研究用不同濃度苯磺隆對兩親本種子進行處理，發現0.15 mg·kg-1苯磺隆濃度下可以顯著區分出2份親本材料的耐性差異，過高或者過低濃度都不利于2個親本耐性差異的選擇，因此，最終選擇0.15 mg·kg-1的苯磺隆濃度作為重組自交系群體的脅迫濃度。該濃度雖然與前人研究結果略有不同，但是差異不大，并且不同的試驗材料對苯磺隆的耐藥性也不盡相同。以該濃度處理F2:7群體175份種子，4個相對性狀均表現出廣泛的表型變異，變異系數范圍為13.5%—36%，說明在0.15 mg·kg-1的苯磺隆濃度脅迫下，研究群體內株系間苯磺隆耐性遺傳差異明顯；4個相對性狀均呈連續性分布，符合數量性狀特征，為進行QTL遺傳分析奠定了基礎。

作物對逆境脅迫的響應是一個復雜的過程，近年來利用分子標記技術對脅迫下油菜耐性QTL進行研究已經較為普遍[13-16,18,20]。關于苯磺隆方面，盡管前人對作物響應苯磺隆脅迫的分子機理已經有了部分研究[6-7,21-23]，但是利用SNP分子標記定位苯磺隆脅迫下油菜萌發期關聯性狀QTL鮮見報道。周清元等[6]通過全基因組關聯分析，找到6個與相對根長顯著關聯SNP標記和4個與相對發芽率顯著關聯標記，主要分布于A03、A04、A05、A07、C02、C03、C06和C09染色體上。本文對重組自交系F2:7群體萌發期的相對發芽勢、相對發芽率、相對根長和相對干重進行QTL分析，共檢測到22個QTL，單個QTL可解釋的表型變異為6.4%—12.6%，大部分表型貢獻率在10%以下，表明苯磺隆脅迫下，種子萌發過程中各性狀多受微效基因調控；檢測到的8個相對根長QTL和3個相對發芽率QTL，與周清元等[6]研究結果差異較大，究其原因，主要在于二者研究群體和處理濃度不同所致。從4個相對性狀QTL結果看，相對根長與相對發芽勢、相對發芽率、相對干重以及相對干重與相對發芽勢、相對發芽率間均不存在相同位點，該結果與性狀之間的相關性吻合，但是不能簡單認為這些性狀間沒有受到同一基因作用，因為QTL檢測結果與效應值大小有關，而一個基因在不同環境條件下對多個性狀效應值大小影響不同。另外，本文在A01染色體64.857、55.935和56.645 cM處檢測到的相對發芽勢與相對發芽率QTL置信區間完全或者部分重疊，表明這些重疊位點存在著“一因多效”作用，即這些重疊位點同時調控種子萌發初期的多個性狀的表達，該結果與相對發芽勢和相對發芽率之間存在的極顯著正相關性結果一致。

3.2 候選基因篩選

植物受到逆境脅迫時會激活一系列分子途徑并調控相關基因表達和生理反應來適應逆境[33]。如Niu等[34]研究發現屬于BHLH亞組的MYC3和MYC4是調控茉莉酸（JA）反應的轉錄激活因子，其活性在逆境條件下受JA信號中JAZ蛋白的控制，BHLH轉錄因子的過表達則導致JA介導的防御反應增強，證實了BHLH轉錄因子與JAZ蛋白相互作用從而響應防御脅迫。本研究在A02染色體上篩選到的基因編碼JAZ6蛋白，編碼BHLH DNA結合超家族蛋白，均參與防御反應調節。本文還找到了1個未知命名的基因，這個基因屬于MATE家族蛋白基因。MATE基因是生物中第五類輸出轉運蛋白，在擬南芥中大概有56個成員[35]，雖然未找到關于MATE家族蛋白與抗除草劑直接關聯的報道，但是多數研究表明MATE基因與類黃酮[36]、生物堿[37]、金屬離子[38]、其他植物代謝物的轉運[39]以及逆境脅迫[40]有關，故推測此基因可能在耐除草劑機制中起作用。另外，本研究篩選到的C07染色體上的基因為LSU2蛋白相關基因，在細胞氧化劑解毒及多種植物防御反應中起作用[41]。

ALS是一種磺酰脲類除草劑靶位點（target-site，TSR）酶，主要負責支鏈氨基酸的生物合成。該酶的抗性突變不僅限制了除草劑的結合，還可能通過改變蛋白質的活性、調控動力學過程而損害正常植物的功能或代謝[42]。前人研究表明抗苯磺隆植株突變體的抗性多是由于ALS突變所致[23,43-44]，并且轉入ALS突變基因的煙草[45]、油菜[22]、大豆[46]等作物均表現出更強的抗除草劑能力。本研究在A06染色體上找到的與擬南芥同源，催化ALS合成，其活性可被磺酰脲類除草劑抑制。

作物抗除草劑機制除了與靶位點突變有關，還與非靶位點（nontarget-site，NTSR）相關酶的代謝能力相關[47]。其中，常見的NTSR相關酶有細胞色素P450單加氧酶、ABC轉運蛋白、GSTs、GTs和過氧化物酶（peroxidase，POD）[48]。前人研究表明磺酰脲類除草劑可誘導和在抗除草劑作物中過表達[49]，百草枯可誘導和的表達[50]，這些CYP450基因最終通過促進除草劑分子代謝解除毒害[51]。本研究在A02、A03、A04、A06、C01和C03染色體上共篩選到18個細胞色素P450基因家族成員，占總數的60%。其中，在A06染色體21 396 095—22 092 492 bp連續找到13個細胞色素P450家族成員。Baek等[52]對除草劑處理過的高粱幼苗進行轉錄組分析發現，多數上調的轉錄物編碼P450、GST和UGT解毒酶。Gaines等[53]在黑麥草的近緣耐藥個體中發現4種過表達基因，其中包括2種細胞色素P450和1種GT基因。Cummins等[54]發現轉入黑麥草的擬南芥植株由于類黃酮和GST的積累對多種除草劑產生抗性。這些研究表明GTs和GSTs在除草劑的解毒方面發揮著重要作用。本研究在A03、A04和C03染色體上篩選到的5個基因均為GT基因家族成員，其中，3個基因屬于UDP-糖基轉移酶家族蛋白；在A04染色體上找到的與擬南芥同源，編碼屬于phi類的谷胱甘肽轉移酶——。ABC轉運蛋白是位于細胞膜上的外排泵，因底物范圍廣泛而具有多藥耐藥性，是抵御外界脅迫的重要屏障[55]，參與多種生物和非生物脅迫反應[56]。Moreira等[57]研究發現雜草經草甘膦、百草枯處理后，ABC轉運蛋白基因的轉錄水平顯著提高，表明了ABC轉運蛋白在除草劑抗性中的重要作用。本研究在A03染色體上篩選到1個，該基因只在胚胎和分生組織中表達，參與由氧化損傷的Fe-S簇的生物發生、修復。周清元等[6]根據6個與相對根長顯著相關的SNP位點和4個與相對發芽勢顯著相關的SNP位點篩選到2個GTs、2個GSTs和6個細胞色素P450s相關基因，但是未找到除草劑靶標ALS基因和ABC轉運蛋白。后續研究將對這些基因進行更深入的驗證以及功能分析，以期為甘藍型油菜耐苯磺隆種質篩選及抗除草劑機理等研究提供參考。

4 結論

苯磺隆脅迫下共檢測到22個油菜種子萌發相關性狀的QTL，可解釋表型變異率為6.4%—12.6%。共篩選到30個與苯磺隆耐性相關候選基因，這些基因可能通過調控乙酰乳酸合成酶、P450酶、糖基轉移酶或者谷胱甘肽轉移酶及其他逆境脅迫相關酶非正常表達，從而影響油菜種子萌發表型差異。

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QTL Mapping and Candidate Genes Screening of Related Traits inL. during the Germination under Tribenuron-Methyl Stress

WANG LiuYan, WANG RuiLi, YE Sang, GAO HuanHuan, LEI Wei, CHEN LiuYi, Wu JiaYi, MENG LiJiao, YUAN Fang, TANG ZhangLin, LI JiaNa, ZHOU QingYuan, CUI Cui

(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】The QTLs and tolerance genes related to the germination characters of rape seeds under the stress of tribenuron-methyl were studied, which laid the foundation for screening and cultivating the germplasm of tribenuron-methyl resistant rape and exploring the molecular mechanism of tribenuron-methyl tolerance during the germination of rape seeds.【Method】A high generation RIL population consisted of 175 lines, which were constructed from the synthetic10D130 and the conventional varietyZS11, was treated with 0.15 mg·kg-1tribenuron-methyl solution for seed germination test and the control was under the distilled water. The phenotypic data that including relative germination vigor (RGV), relative germination rate (RGR), relative root length (RRL) and relative dry weight (RDW) were analyzed by Excel software. Then, the RIL population was genotyped with 6K SNP chip, and the high-density genetic linkage map was constructed by JoinMap4.0 software. Based on the genetic map, the relative values of four characters were mapped by using Multiple QTL mapping method of MapQTL software. And the genes sequence ofwere searched according to the confidence interval of each QTL, next, blast withgenome sequence in turn and select the candidate genes that may be related to the tolerance to tribenuron-methyl stress.【Result】The frequency distribution of each traits for RIL population's was continuous with the large variation range, which were consistent with the characteristics of quantitative characters, so it were suitable for the detection of QTL. Correlation analysis showed that there was a significant positive correlation between RGR and RGV, and the correlation coefficient was 0.587. In addition, the constructed genetic map contained 1 897 polymorphic SNP markers covering 3 214.19 cM of the genome ofwith an average map distance of 1.69 cM. By this map, 22 QTLs related to 4 phenotypic traits were detected and the phenotypic contribution rate was between 6.4% and 12.6%. Among them, there were 6 and 3 QTLs related to RGV and RGR, 8 and 5 QTLs related to RRL and RDW, respectively. Also, the confidence intervals of QTLs for RGV and RGR were found to overlap completely or partially at 64.857 cM, 55.935 cM and 56.645 cM of chromosome A01. Through sequence alignment, 30 candidate genes were screened, including 18 cytochrome P450 family members, 5 glycosyltransferase family genes, 1 GSTF related gene, 1 ABC transporter related gene and 1 ALS gene, all of which were detoxified by accelerating metabolism, and related to the mechanism of herbicide resistance, especially ALS is the target enzyme of sulfonylurea herbicide. Furthermore, others genes were screened, including 1 BHLH gene and 1 JAZ6 gene which could interact to protect against stress; and 1 LSU2 protein gene which was involved in the detoxification of cell oxidants and plant defense response; and 1 MATE family member which was involved in the transport of flavonoids, alkaloids, metal ions, other metabolites and plant stress response caused by toxic substances.【Conclusion】22 QTLs that significantly associated with tribenuron-methyl tolerance related traits and 30 candidate genes for the tolerance to tribenuron-methyl were found. These genes are involved in the stress response caused by toxic substances by accelerating the transport and metabolism of toxic molecules, which may be related to the resistance regulation and response mechanism of plants to tribenuron-methyl.

tribenuron-methyl;L.; germination; QTL; candidate genes

2019-08-09；

2019-11-14

國家重點研發計劃（2018YFD0100500）、國家農業部現代農業產業技術體系（CARS-12）、重慶市技術創新與應用發展（cstc2019jscx- msxmX0383）

王劉艷，E-mail：810980572@qq.com。通信作者周清元，E-mail：zhouqy2005@163.com。通信作者崔翠，E-mail：cuigreeny@163.com

（責任編輯 李莉）