松針多糖對雞巨噬細胞HD11的天然免疫調節

崔小珍，欒艷，李婷婷，楊裕，關文超，張凱，王福傳，宋獻藝

松針多糖對雞巨噬細胞HD11的天然免疫調節

崔小珍1，欒艷2，李婷婷3，楊裕1，關文超1，張凱1，王福傳1，宋獻藝1

（1山西省農業科學院飼料獸藥研究所，太原 030036；2湖北省宜昌市夷陵區畜牧技術推廣站，湖北宜昌 443100；3山西省農業科學院 畜牧獸醫研究所，太原 030032）

【】探討松針多糖對雞巨噬細胞HD11的天然免疫功能的影響，以期為松針多糖在肉雞疾病防治方面應用提供科學依據。試驗采用不同濃度的的松針多糖作用于巨噬細胞HD11，試驗分為空白對照組、陽性對照組（終濃度為1 μg·mL-1的LPS）和松針多糖組（終濃度分別為25、50、100、200、400 μg·mL-1的松針多糖）。噻唑藍（MTT）檢測巨噬細胞HD11細胞活性、Griess法檢測巨噬細胞HD11細胞上清液中一氧化氮（NO）分泌量、中性紅吞噬試驗檢測巨噬細胞HD11吞噬活性，酶聯免疫（ELISA）檢測巨噬細胞HD11細胞上清液中干擾素-α（IFN-α）、一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-10（IL-10）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量，熒光定量PCR技術檢測HD11細胞中iNOS mRNA表達。MTT試驗結果表明：與空白對照組相比，不同濃度的松針多糖（25、50、100、200、400 μg·mL-1）對細胞活性沒有影響，說明在25-400 μg·mL-1范圍內對巨噬細胞沒有毒性，可以進行免疫調節作用實驗。免疫調節作用試驗結果表明：與空白對照組相比，不同濃度的松針多糖極顯著（＜0.01）增加了NO釋放量和細胞吞噬活性，極顯著（＜0.01）或顯著（＜0.05）提高了細胞因子IFN-α的含量和iNOS的含量及mRNA的表達量，極顯著（＜0.01）或顯著（＜0.05）降低了細胞因子IL-10的分泌量。當松針多糖濃度在50、100、200、400 μg·mL-1濃度時，細胞因子IL-6和TNF-α的含量極顯著（＜0.01）高于空白對照組。與陽性對照組相比，不同濃度的松針多糖極顯著（＜0.01）降低NO釋放量，極顯著（＜0.01）或顯著（＜0.05）降低了細胞因子IFN-α的含量、iNOS的含量及mRNA表達量和IL-10含量。當松針多糖濃度在25、50、100 μg·mL-1濃度時，細胞吞噬活性極顯著（＜0.01）低于陽性對照組，細胞因子IL-6的含量極顯著（＜0.01）低于陽性對照組。當松針多糖濃度在25、50、100、200 μg·mL-1濃度時，細胞因子TFN-α的含量極顯著（＜0.01）低于陽性對照組。松針多糖能顯著提高巨噬細胞HD11的天然免疫調節能力，且存在劑量依賴效應。

松針多糖；巨噬細胞；免疫調節；細胞因子

0 引言

【研究意義】植物多糖是一種具有多種生理功能和開發價值的活性多糖，對動物有促生長、抗氧化和免疫調節等生理功能[1-3]。由于來源廣泛、毒副作用小、功能多樣等優點，已經被廣泛用于動物健康養殖和疾病防控中。【前人研究進展】目前研究最多的是多糖的免疫功能，眾多研究表明許多植物多糖都具有促進免疫細胞功能、提高巨噬細胞活性等多種生物學功能[4-5]。松針為松科植物的葉，松針有動物所需的9 種必須氨基酸，另外還有糖類、粗蛋白、多種維生素、多種礦物質元素和多種生物活性物質，包括各種酶類、活性輔酶和活性黃酮、多糖、皂甙等活性成分，具有增強免疫力，提高抗病能力的作用。松針多糖是從松針中提取的植物多糖，是松針的有效成分之一。有研究表明，松針多糖在提高肉雞的免疫功能和生長性能上能發揮作用[6]，也有研究表明[7]松針多糖具有促炎作用，可調節小鼠巨噬細胞的免疫功能，進而增強機體抗疾病的能力。【本研究切入點】機體非特異性免疫主要由體內分泌的殺菌物質和吞噬細胞以及皮膚、黏膜組成。植物多糖一般是通過調節巨噬細胞的活性、自然殺傷性細胞活性、補體系統、干擾素的含量、細胞因子的含量等來影響機體的天然免疫。而松針多糖對雞巨噬細胞HD11的天然免疫功能如何調節，尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過研究松針多糖對雞巨噬細胞HD11的活性和天然免疫調節作用，為促進松針資源在動物生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2018年11月1日至2019年1月29日在山西省太原市小店區山西省農業科學院飼料獸藥研究所。

1.1 試驗材料

雞巨噬細胞HD11，購自吉林大學動物醫學學院預防實驗室；松針多糖購自沃特萊斯生物科技有限公司，經實驗室采用蒽酮硫酸比色法測定多糖的含量為80%；RPMI-1640培養基和脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司；新生胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液、噻唑藍（MTT）、中性紅和二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶公司；一氧化氮（NO）試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司；雞干擾素-α（IFN-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、誘導性一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Multiskan MK3酶標儀購自美國Thermo；CO2培養箱購自德國eppedorf公司；HFsafe-1500LC生物安全柜購自上海力申科學儀器有限公司；低速離心機購自上海安亭科學儀器廠；倒置生物顯微鏡購自德國Leica公司。SW-CJ-1D潔凈工作臺購自江蘇蘇潔凈化設備廠；HC-2518R高速冷凍離心機購自安徽中科中佳儀器有限公司；SM- A4000微量分光光度計購自merinton；StepOne型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 松針多糖對雞巨噬細胞活力的影響 取對數生長期的HD11，調整細胞密度為1×104個/孔接種于96孔板，加入不同濃度的松針多糖（25、50、100、200、400 μg·mL-1）和1 μg·mL-1LPS 200 μL/孔，并設空白對照組，每組設5個重復，37℃培養24 h后每孔加入10 uL MTT染色液，繼續培養4 h，然后每孔加入100 μL Formanzan溶解液，37℃孵育4 h（結晶紫全部溶解）后，在酶聯免疫檢測儀570 nm測定吸光度。

1.2.2 松針多糖對肉雞巨噬細胞吞噬活性的影響 取對數生長期的巨噬細胞按每孔1×104個/孔接種于96孔板，加入不同濃度的松針多糖（25、50、100、200、400 μg·mL-1）和1 μg·mL-1LPS 100 μL/孔，并設空白對照組，每組設5個重復，培養24 h后，棄去培養液加入1 mg·mL-1的中性紅生理鹽水溶液100 μL/孔，繼續培養30 min，傾去上清液，用PBS洗3遍，每孔加入細胞裂解液（乙醇﹕冰醋酸=1﹕1）200 μL，室溫下放置2 h，待細胞溶解后，在酶標儀上測定540 nm處吸光度。吞噬率按下式計算：細胞吞噬率=（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。

1.2.3 Griess法測定NO濃度 吸取1.2.2松針多糖對肉雞巨噬細胞吞噬活性的影響實驗的細胞上清液，按照50 μL/孔，加入96孔板中，每孔加入50 μL室溫Griess I，輕混勻；每孔加入50 μL室溫GriessⅡ，輕混勻；酶標儀540 nm測吸光度。

1.2.4 細胞因子檢測 取對數生長期的細胞按1×105每孔加入96孔細胞培養板中，加入不同濃度的松針多糖（25、50、100、200、400 μg·mL-1）和1 μg·mL-1LPS 100 μL/孔，并設空白對照組，每組設5個重復，培養24 h后，取培養上清液，按ELISA試劑盒說明書操作檢測IFN-α、IL6、IL-10和TNF-α的含量。

1.2.5 iNOS mRNA表達量的檢測 以GAPDH為內參，應用軟件Primer5.0設計引物，由上海華大基因公司合成。引物序列詳見表1。收集1.2.4細胞因子檢測的細胞，采用Trizol裂解法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，按照試劑盒說明，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測iNOS mRNA的表達水平。qRT-PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性3s，60℃退火30s，45個循環。將細胞送到上海生工生物有限責任公司檢測iNOS mRNA的表達。Real-time PCR 結果采用2-ΔΔCT方法獲得目的基因的相對表達量，ΔΔCT=（CT目的基因-CT管家基因）試驗組-（CT目的基因- CT管家基因）對照組，CT 就是光吸收值達到域值（Threshold）所需的循環數（Cycle）[8]。

1.3 統計分析

采用 SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan氏法進行多重比較，結果均以“平均值±標準誤”表示。＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

表1 熒光定量 PCR引物序列

2 結果

2.1 松針多糖對雞巨噬細胞HD11活力的影響

通過MTT檢測雞巨噬細胞HD11活力試驗，松針多糖對雞巨噬細胞HD11活力有促進作用，松針多糖組細胞活性極顯著（＜0.01）高于空白對照組，表明松針多糖在25—400 μg·mL-1質量濃度時作用24 h對細胞沒有毒性，因此，在此濃度范圍內評價松針多糖對巨噬細胞HD11的免疫調節作用（表2）。

2.2 松針多糖對雞巨噬細胞NO分泌量的影響

通過對NO的檢測，得出松針多糖組NO分泌量極顯著（＜0.01）高于空白對照組，極顯著（＜0.01）低于脂多糖組，且隨著松針多糖濃度的增加，NO的分泌量升高（表3）。

2.3 松針多糖對雞巨噬細胞吞噬率的影響

通過巨噬細胞吞噬中性紅試驗，松針多糖組的吞噬率極顯著（＜0.01）高于空白對照組，且隨著松針多糖的濃度增加，吞噬率升高；與脂多糖組相比，松針多糖的吞噬率下降，且松針多糖（25、50，100 μg·mL-1）組極顯著低于（＜0.01）脂多糖組（表4）。

表2 松針多糖對雞巨噬細胞增殖活性的影響

同行數據后所標字母相異表示差異顯著（＜0.05），所標字母相同表示差異不顯著（＞0.05）。下同

Different letters in the same row means significant difference between the treatments(＜0.05), same letter in the same row means not significant difference between treatments (＞0.05). The same as below

表3 松針多糖對雞巨噬細胞NO分泌量的影響

表4 松針多糖對雞巨噬細胞吞噬中性紅的影響

2.4 松針多糖對雞巨噬細胞因子IFN-α、IL-6、IL-10、INOS和TNF-α分泌的影響

通過對雞巨噬細胞因子的檢測，松針多糖組的IFN-α和INOS分泌量極顯著（＜0.01）或顯著（＜0.05）高于空白對照組，且隨著松針多糖的濃度增加，IFN-α、INOS分泌量增加；與脂多糖組相比，松針多糖組的IFN-α、INOS分泌量極顯著（＜0.01）或顯著（＜0.05）降低。松針多糖組（50、100、200、400 μg·mL-1）的IL-6和TNF-α分泌量極顯著（＜0.01）高于空白對照組，且隨著松針多糖的濃度增加，IL-6和TNF-α分泌量增加；與脂多糖組相比，松針多糖組（25、50、100 μg·mL-1）的IL-6分泌量極顯著（＜0.01）降低，松針多糖組（25、50、100、200 μg·mL-1）的TNF-α分泌量極顯著（＜0.01）降低；松針多糖組的IL-10極顯著（＜0.01）低于空白對照組和脂多糖組（表5）。

2.5 松針多糖對雞巨噬細胞因子iNOS mRNA表達量的影響

通過對巨噬細胞中iNOS mRNA表達量的檢測，松針多糖組的iNOS mRNA表達量極顯著（＜0.01）或顯著（＜0.05）高于空白對照組，極顯著（＜0.01）低于脂多糖組，松針多糖組的iNOS mRNA表達量與松針多糖濃度呈正相關（表6）。

3 討論

大量研究表明多糖具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等，但是免疫調節活性被公認為是多糖最重要的生物活性[9]。王晶等[10]研究表明鱗柄小奧德蘑多糖可能通過提高細胞對NO和多種免疫相關信號分子的分泌量，增強細胞的吞噬能力，進而調節小鼠巨噬細胞的免疫功能；王蓉[5]等研究表明在體外，沙棘多糖能夠顯著促進巨噬細胞的增殖，促進細胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、NO的釋放；戴藝等[7]研究表明松針多糖在體外具有促炎作用，可調節小鼠巨噬細胞的免疫功能，進而增強機體抗疾病的能力；呂夢云[6]等研究表明松針多糖在雞體內可以提高肉雞血清中白介素2和腫瘤壞死因子濃度，加強肉雞免疫機能。松針多糖在雞體外對免疫細胞的調節作用尚未報道，本試驗研究松針多糖在體外對巨噬細胞天然免疫功能的影響。

表5 松針多糖對雞巨噬細胞因子IFN-α，IL-6，IL-10，iNOS和TNF-α分泌的影響

表6 松針多糖對雞巨噬細胞因子iNOS mRNA表達量的影響

巨噬細胞是先天性細胞免疫的重要組成部分，具有較強的吞噬殺傷病原體、抗原提呈、分泌細胞因子參與機體的免疫調節等多種生物學活性[11-17]，巨噬細胞成為針對微生物入侵的第一道防線[18-19]，激活巨噬細胞是先天和適應性免疫防御病原體的一個關鍵事件[20-22]。吞噬功能是巨噬細胞十分重要的功能之一，巨噬細胞通過吞噬侵入的病原體及體內衰老、畸變的細胞而提高機體的抗感染能力[23]。吞噬能力是衡量巨噬細胞活性的一個重要指標[24]，中性紅法可以用來評價巨噬細胞的吞噬功能[25]。在本試驗中用中性紅檢測雞巨噬細胞HD11的吞噬能力，結果表明松針多糖可以增強巨噬細胞的吞噬能力，從而提高機體的免疫能力。

巨噬細胞的免疫調節作用主要靠其吞噬功能及分泌一些細胞因子（IL-10，IL-6，TNF-α，IFN-α）來實現的。NO是巨噬細胞發揮吞噬作用的基本條件，隨著NO釋放量的逐步升高，巨噬細胞吞噬能力也增強[26]。用Griess 法測定NO生成量，結果表明松針多糖能顯著提高巨噬細胞的NO釋放。NO的合成主要受一氧化氮合酶（iNOS）的調節[27]，為了進一步確認松針多糖對巨噬細胞產生NO的誘導作用，本研究檢測了iNOS的基因表達，結果證明松針多糖能夠明顯增強巨噬細胞iNOS的基因表達水平，提示松針多糖通過促進巨噬細胞iNOS的表達，從而提高NO的生成，從而促進巨噬細胞的吞噬能力。

巨噬細胞分泌的細胞因子是由多種細胞產生的多肽分子，通過調節細胞分化、生長和凋亡控制整個機體的動態平衡，對天然免疫和適應性免疫均有調控作用[28]。TNF-α是一種主要由巨噬細胞和淋巴細胞分泌的細胞因子，TNF-α在宿主防御中起著重要的作用，它通過各種細胞包括負責細胞激活系統的單核吞噬細胞促進炎癥發生，是一種炎癥關鍵因子[29-30]，與TNF-α相似，IL-6也是重要的促炎癥介質，能夠增強巨噬細胞的敏感性，結合相應的受體，然后繼續作為刺激信號激活更多的巨噬細胞，促進炎癥的發展[31-32]。干擾素（IFN-α）是一組具有多種功能的活性蛋白質（主要是糖蛋白），是一種由單核巨噬細胞和淋巴細胞產生的細胞因子，干擾素主要在機體內發揮抗病毒、抗腫瘤、以及免疫調節效應等功能，在天然免疫中尤為重要，是抗病毒感染的第一道防線。病毒或其他病原微生物感染細胞后，大部分細胞中的IFN-α會大量表達，產生一系列的抗病毒效應，從而增強機體的先天性免疫[27]。IL-10是目前體內最重要的抗炎因子，主要由單核巨噬細胞、淋巴細胞等分泌，它能減少多種促炎因子的產生，血漿IL-10 水平升高代表機體抗炎反應增強，減輕促炎因子對機體的損傷，具有良好的抗炎和免疫功能[33]。試驗結果表明，松針多糖能促進雞巨噬細胞HD11表達促炎因子TNF-α、IL-6、IFN-α，抑制抑炎因子IL-10基因的表達，從而發揮其促炎作用并增強其固有免疫應答。

4 結論

松針多糖能增強HD11的吞噬能力，能通過調節iNOS、NO和細胞因子的分泌量調節HD11的天然免疫功能，為松針多糖在雞上的應用打下理論基礎。

[1] LERIO J M, CASTRO R, ARRANZ J A, LAMAS J. Immunomodulating activities of acidic sulphated polysaccharides obtained from the seaweed Ulva rigida C. Agardh.2007, 7(7): 879-888.

[2] KIHO T, MORIMOTO H, KOBAYASHI T, USUI S, UKAI S, AIZAWA K, INAKUMA T. Effect of a polysaccharide ( TAP) from the fruiting bodies ofon glucose metabolism in mouse liver.2000, 64(2): 417-419.

[3] HONG Y K, WU H T, MA T, LIU W J, HE X J. Effects of Glycyrrhiza glabra polysaccharides on immune and antioxidant activities in high-fat mice.2009, 45(1): 61-64.

[4] 王湘嬋, 夏永軍, 王光強, 艾連中, 賴鳳羲, 熊智強. 細蟲草胞外多糖對小鼠腹腔巨噬細胞免疫功能研究. 工業微生物, 2019, 49(3): 7-12.

WANG X C, XIA Y J, WANG G Q, AI L Z, LAI F X, XIONG Z Q. Immunomodulatory effect of polysaccharide fromMontag on murine peritoneal macrophages., 2019, 49(3): 7-12. (in Chinese)

[5] 王蓉, 李勝男, 陳春, 劉振康, 原永芳. 沙棘多糖對巨噬細胞和免疫抑制小鼠的免疫調節研究. 中南藥學, 2020, 3(18): 384-388.

WANG R, LI S N, CHEN C, LIU Z K, YUAN Y F. Immunomodulatory effect of hippophae rhamnoides polysaccharide on the macrophages and cyclophosphamide-induced immuno- compromised mice., 2020, 3(18): 384-388. (in Chinese)

[6] 呂夢云, 胡耀, 陳偉, 歐陽克蕙, 黎雄, 熊小文, 溫慶琪. 松針多糖對肉雞生產性能和免疫功能的影響. 草業科學, 2016, 33(8): 1633-1639.

LV M Y, HU Y, CHEN W, OUYANG K H, LI X, XIONG X W, WEN Q Q. Effects of pine polysacharide on growth performance and immune functions of broilers., 2016, 33(8): 1633-1639. (in Chinese)

[7] 戴藝, 徐明生, 上官新晨, 蔣艷, 鄭國棟, 王文君. 松針多糖對小鼠腹腔巨噬細胞免疫調節作用的研究. 動物營養學報, 2017, 29(2): 670-677.

DAI Y, XU M S, SHANGGUAN X C, JIANG Y, ZHENG G D, WANG W J. Immunomodulatory effect of pine polysacharide on mice peritoneal macrophages.2017, 29(2): 670-677. (in Chinese)

[8] KENNETH J L, THOMAS D S. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod., 2001, 25: 402-408.

[9] OOI VEC, LIU F. A review of pharmacological activities of mushroom polysaccharides.1999, 1(3): 195-206.

[10] 王晶, 史琪, 隨晶晶, 常世民, 杜娟, 閆訓友. 鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細胞免疫功能的調節作用. 天然產物研究與開發: 1-9 [2020-05-25]. http://kns.cnki.net/kcms/ detail /51.1335.Q.20200427. 1558.004.html.

WANG J, SHI Q, SUI J J, CHANG S M, DU J, YAN X Y. Immunomodulatory effect of polysaccharide fromon murine macrophages.: 1-9 [2020-05-25]. http://kns.cnki.net/kcms/detail /51. 1335.Q. 20200427.1558.004.html. (in Chinese)

[11] TAYLOR P R, MARTINEZ-POMARES L, STACEY M, LIN H H, BROWN G D, GORDON S. Macrophage receptors and immune recognition., 2005, 23(1): 901-944.

[12] TWIGG III H. Macrophages in innate and acquired immunity.2004, 25(1): 21-31.

[13] ARIAANS M P, MATTHIJS G R M, HAARLEM D V, HAAR P V D, HENSEN E J, VERVELDE L. The role of phagocytic cells in enhancedsusceptibility of broilers to colibacillosis after Infectious Bronchitis

Virus infection.2008, 123(3/4): 240-250.

[14] LI D, XUE M, GENG Z, CHEN P. The suppressive effects of bursopentine (BP5) on oxidative stress and NF-κB activation in lipopolysaccharide-activated murine peritoneal macrophages., 2012, 29(1/2): 9-20.

[15] OKAMURA M, LILLEHOJ H S, RAYBOURME R B, BABU U S, HECKERT R A, TANI H, SASAI K, BABA E, LILLEHOJ E P. Differential responses of macrophages to Salmonell-a enterica serovars Enteritidis and Typhimurium., 2005, 107(3/4): 327-335.

[16] WITHANAGE G S K, MASTROENI P, BROOKS H J, MASKELL D G, MCCONNELL I. Oxidative and nitrosative responses of the chicken macrophage cell line MQ-NCSU to experimentalinfection., 2005, 46(3): 261-267.

[17] PENG L, MATTHIJS M G R, HAAGSMAN H P, VELDHUIZEN E J A. Avian pathogenic,-induced activation of chicken macrophage HD11 cells., 2018, 87: 75-83.

[18] JOSE M L, CASTRO R, ARRANZ J A, LAMAS J. Immunomodulating activities of acidic sulphated polysaccharides obtained from the seaweed Ulva rigida C. Agardh.2007, 7(7): 879-888.

[19] DUNN D L, BARKE R A, EWALD D C, SIMMONS R L. Macrophages and translymphatic absorption represent the first line of host defense of the peritoneal cavity.1987, 122(1): 105-110.

[20] PEI C Z, ZHANG Y, WANG P, ZHANG B J, FANG L, LIU B, MENG S. Berberine alleviates oxidized low-density lipoprotein- induced macrophage activation by downregulating galectin-3 via the NF-κB and AMPK signaling pathways., 2019, 33(2): 294-308.

[21] KRZYSZCYZK P, SCHLOSS R, PALMER A, BERTHIAUME F. The role of macrophages in acute and chronic wound healing and interventions to promote pro-wound healing phenotypes., 2018, 9: 419.

[22] LEE K Y, JEON Y J. Macrophage activation by polysaccharide isolated from., 2005, 5(7): 1225-1233.

[23] 葉莎莎, 曾耀英, 尹樂樂. 紅景天苷對小鼠腹腔巨噬細胞體外增殖、凋亡、吞噬、ROS和NO產生的影響. 細胞與分子免疫學雜志, 2011, 27(3): 237-241.

YE S S, ZENG Y Y, YIN L L. Effects of salidroside on proliferration apoptosis, phagocytosis, ROS and NO production of murine peritonealm acrophages., 2011, 27(3): 237-241. (in Chinese)

[24] ANIL KUMAR C, REKHA J, SOUREN P, SUN C K. Potentiation of macrophage activity by thymol through augmenting phagocytosis., 2014, 18(2): 340-346.

[25] 吳怡亮, 仲磊, 馬寧, 裴斐, 馬高興, 胡秋輝. 大豆蛋白-杏鮑菇多糖共價結合物對RAW264.7細胞的免疫調節作用. 食品科學, 2019, 40(17): 202-207.

WU Y L, ZHONG L, MA N, PEI F, MA G X, HU Q H. Immunoregulatory effect of soybean protein isolate-pleurotus eryngii polysaccharide conjugate on RAW264.7 cells., 2019, 40(17): 202-207.(in Chinese)

[26] 張永紅, 官佳懿, 崔德鳳, 谷崇高, 徐雙, 李洋, 沈紅. 綠原酸對小鼠不同組織巨噬細胞增殖、分泌及吞噬功能的影響. 動物醫學進展. 2014, 35(9): 46-51.

ZHANG Y H, GUAN J Y, CUI D F, GU C G, XU S, LI Y, SHEN H. Effects of chlorogenic acid on proliferation, secretion and phagoeytosis functions of different tissue phagocytes in mice., 2014, 35(9): 46-51. (in Chinese)

[27] QI X F, LIU C H, LI R Q, ZHANG H Z, XU X G, WANG J Y. Modulation of the innate immune-related genes expression in H9N2avian inflfluenza virus-infected chicken macrophage-like cells (HD11) in response toLPS stimulation., 2017, 111: 36-42.

[28] HADDAD J J. Cytokines and related receptor-mediated signaling pathways., 2002, 297(4): 700-713.

[29] SCLAVONS C, BURTEA C, BOUTRY S, LAURENT S, ELST V, MULLER R N. Phage display screening for tumor necrosis factor-α- binding peptides: Detection of inflammation in a mouse model of hepatitis.2013, 2013: 1-9.

[30] DAVID B, ROBERT E, IGOR E, LINO B, JON L. Pain and analgesia: the value of salience circuits., 2013, 104: 93-105.

[31] HUNTER C A, JONES S A. IL-6 as a keystone cytokine in health and disease., 2015, 16 (5): 448-457.

[32] TANIGUCHI K, KARIN M. IL-6 and related cytokines as the critical lynchpins between inflammation and cancer., 2014, 26(1): 54-74.

[33] PENG L, MATTHIJS M G R, HAAGSMAN H P, VELDHUIZEN. Avian pathogenic-induced activation of chicken macrophage HD11 cells.2018, 87: 75-83.

Innate Immunomodulatory Effect of Pine Needle Polysaccharide on Chicken Macrophage Hd11

CUI XiaoZhen1, LUAN Yan2, LI TingTing3, YANG Yu1, GUAN WenChao1, ZHANG Kai1, WANG FuChuan1, SONG XianYi1

(1Feed and Veterinary Medicine Research Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030036;2Animal Husbandry Technology Promotion Station of Yiling, Yichang 443100, Hubei;3Animal Husbandry and Veterinary Science Research Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032)

【】 The innate immunomodulatary effect of pine needle polysaccharide on chicken macrophage HD11 were examined to provide theoretical ground for broiler disease prevention and treatment.【】Different concentrations of pine needle polysaccharide were used to treat the macrophage HD11. The experiment was divided into blank control group, positive control group (1 μg·mL-1was the final concentration of LPS), and pine needle polysaccharide group (25, 50, 100, 200 and 400 μg·mL-1were the final concentration of pine needle polysaccharide). MTT method was used to evaluate the effect of pine needle polysaccharide on the proliferation of HD11 cells. the content of NO in the supernatant of HD11 cells was determined, phagocytic function was detected by neutral red, the release of IFN-α, iNOS, IL-10, IL-6 and TNF-α were detected by ELISA, the levels of iNOS mRNA in the HD11 cells were detected by PCR.【】The results of MTT show, there was no significant difference among all groups (25, 50, 100, 200, 400 μg·mL-1) in proliferation of HD11 cells. It indicated that there was no toxicity to macrophages in the range of 25-400 μg·mL-1, and the immunoregulation experiment could be carried out. The immunomodulatory test results showed that, the concentration of NO, phagocytic function were higher significantly (＜0.01) than control group. The release of cytokines IFN-α and iNOS were higher significantly (＜0.01 or＜0.05) than control group. The amount of cytokines IL-10 was lower significantly (＜0.01 or＜0.05) than control group. The content of cytokines IL-6 and TNF-α were higher significantly (＜0.01) than control group when the pine needle polysaccharide concentration were 50, 100, 200, 400 μg·mL-1. the concentration of NO was lower significantly (＜0.01) than positive control group. The release of cytokines IFN-α, iNOS and IL-10 were lower significantly (＜0.01 or＜0.05) than positive control group. The phagocytic function and the content of cytokines IL-6 was lower significantly (＜0.01) than positive control group when the pine needle polysaccharide concentration were 25, 50, 100 μg·mL-1. The content of cytokines TNF-α was lower significantly (＜0.01) than positive control group when the pine needle polysaccharide concentration were 25, 50, 100, 200 μg·mL-1.【】 The results showed that pine needle polysaccharide can activate macrophages and enhance the innate immune function of macrophages HD11, and there was a dose-dependent effect.

needles polysaccharide; macrophage; immune regulation; cytokine

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.017

2019-08-23；

2020-06-30

山西省重點研發計劃項目（201903D421040）、山西省農業科學院博士研究基金（YBSJJ1711）、山西省重點研發計劃重點項目（201603D21109-1）、山西省面上青年基金項目（201701D221198）

崔小珍，Tel：0351-7187658；E-mail：cuiyuchan.002@163.com。通信作者宋獻藝，E-mail：sxnysxy@163.com

（責任編輯 林鑒非）