應用GST pull-down技術篩選番茄SIVQ6互作蛋白

原貴波，莫雙榕，錢瑩，臧棟楠，楊帆，蔣紅亮，武媛，丁海東

應用GST pull-down技術篩選番茄SIVQ6互作蛋白

原貴波，莫雙榕，錢瑩，臧棟楠，楊帆，蔣紅亮，武媛，丁海東

（揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

【】含有VQ基序（VQ）的蛋白質是植物特異性蛋白質，具有保守的“FxxhVQxhTG”氨基酸序列，調節植物生長和發育。番茄SlMPK1在高溫脅迫過程中發揮重要作用，酵母雙雜交（Y2H）顯示SlVQ6蛋白能夠與SlMPK1相互作用，通過GST pull-down技術進一步驗證SlMPK1與SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作網絡，為研究SlVQ6介導的高溫應答信號通路奠定基礎。通過pGEX-4T-1-PC-VQ6質粒構建，以含有目的基因的菌液為模板，設計特異性引物，擴增目的基因序列，將獲得的目的基因克隆到載體pGEX-4T-1的HⅠ和Ⅰ的酶切位點之間，將獲得的重組質粒pGEX-4T-1-PC-VQ6轉入TOP10克隆菌株經IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）誘導表達，通過GST柱親和純化獲得目標蛋白PC-VQ6，進而獲得預期GST-SlVQ6融合蛋白，通過體外磷酸化進一步確定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物；以GST-SlVQ6為誘餌蛋白固定于GST Sepharose Beads上，與番茄葉片總蛋白孵育后洗脫，收集洗脫液進行SDS-PAGE凝膠電泳驗證，通過LC-MS/MS檢測SlVQ6可能互作的候選蛋白，并對篩選的SIVQ6互作蛋白通過GO、KEGG和蛋白互作網絡進行生物信息學分析。成功構建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重組表達質粒，并獲得帶有GST標簽的GST-SlVQ6融合蛋白，其分子量大小約為54 kD；將GST-SlVQ6和His-SlMPK1進行體外磷酸化試驗，SlMPK1能夠磷酸化SlVQ6，而作為陰性對照的GST與SlMPK1無相互作用，且SlVQ6不存在自磷酸化的現象，表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用，且SlVQ6是SlMPK1的下游底物；以GST-SlVQ6融合蛋白為誘餌蛋白（空GST為陰性對照），利用pull-down試驗篩選番茄葉片組織蛋白中與SlVQ6蛋白結合的蛋白，經SDS-PAGE分離、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）鑒定以及Mascot與蛋白數據庫檢索，共鑒定出37個與SlVQ6結合的蛋白，包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B（RACK1B），通過GO、KEGG和蛋白互作網絡的生物信息學分析，表明這些蛋白參與多種信號通路，其中8個核糖體蛋白可能與高溫脅迫密切相關。SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白，且37個蛋白可能與SlVQ6互作，這些蛋白與脅迫反應有著密切的聯系，可能會在提高番茄植株高溫耐受性等方面發揮重要作用。

番茄；SlVQ6；SlMPK1；pull-down；互作蛋白

0 引言

【研究意義】在植物生長過程中，高溫是常見的環境脅迫因子，對植物的生長發育、品質及產量有著極其重要的影響。隨著全球氣候變暖，溫室效應加劇，嚴重影響了農業和農產品的安全。番茄作為世界上最受歡迎和廣泛消費的蔬菜之一，限制其生產力的主要因素就是高溫，高溫影響各種核酸、蛋白質和細胞骨架結構的穩定性，并改變細胞內酶的催化效率，導致代謝失衡[1-2]，它對番茄的營養和繁殖階段產生不利影響，最終降低產量和果實品質[3-4]。根據Ding等[5]在番茄中鑒定出26種SlVQ蛋白，發現SlVQ6在番茄不同組織器官中均為高效表達，在擬南芥中顯示異位過表達SlVQ6能夠降低高溫耐受性。因此，SlVQ6可能在番茄生長發育過程中尤其在響應高溫信號傳導過程中起到重要作用。【前人研究進展】VQ蛋白家族是一類植物特有的蛋白，含有保守VQ基序（FxxxVQxxTG）的植物特異性轉錄調節子家族被命名為VQ蛋白，這些含有VQ基序的蛋白質，廣泛分布于不同物種中[6-8]。VQ基序對VQ蛋白的功能或作用至關重要。例如，VQ基序影響蛋白質定位和蛋白質-蛋白質相互作用[9-13]。VQ蛋白調節植物的生長和發育、種子發育，響應不同脅迫和光形態建成[7]。在擬南芥中，HAIKU1（VQ14）調節胚乳生長和種子大小[10]。AtVQ8突變體表現出淡綠色和發育不良，表明AtVQ8調節葉綠體發育或光系統組裝[7]。AtVQ18和AtVQ26通過與ABI5轉錄因子相互作用進而在擬南芥種子萌發和早期幼苗建立的過程中發揮作用[14]。過表達植株的下胚軸長度在遠紅光或弱光情況下顯著長于野生型，而缺失突變株的下胚軸長度顯著短于野生型，表明在植物光形態建成中發揮重要作用。VQ29可與光敏色素結合因子（PIF1）互作，進而影響下游基因的轉錄表達[13]。越來越多的證據表明，VQPs不僅參與植物生長發育過程如種子萌發、胚軸伸長、光形態建成等，還參與植物的環境脅迫應答反應如鹽害、干旱、病原菌等。Wang等[15]通過對擬南芥和研究，發現過量表達這兩種基因的植株對病原菌高度敏感，而突變株抗病性則顯著提高。Hu等[12]研究發現過表達對NaCl敏感，而其突變體在NaCl處理下表現出較高的萌發率和較好的生長力。目前，關于VQPs的作用機理主要集中在兩方面：其一是與WRKY互作；其二是被MAPK磷酸化[16]。SIB1和SIB2可與WRKY33的保守區域WRKY結合，提高后者與W-box的結合能力，正調控植物的抗病能力[11]，而AtVQ9與WRKY8互作則負調控植物耐鹽能力[12]。LEI等[17]研究表明AtVQ20通過與AtWRKY2/AtWRKY34的相互作用調控花粉發育。AtVQ14同樣是與WRKY家族來共同調節種子大小和胚乳生長[10]。AtVQ21/MKS1首先作為AtMPK4的底物被發現，AtVQ21可與AtMPK4和AtWRKY33形成相互作用復合體，當受到生物脅迫后，AtVQ21與AtWRKY33復合體從AtMPK4激酶中釋放出來，迅速與抗毒素基因的啟動子結合，調控基因表達，從而調節植物生長和抗病性[18-19]。近年來，越來越多的植物VQ蛋白被鑒定出來，在水稻[20]、擬南芥[7]、玉米[21]、大豆[22]、葡萄[23]、大白菜[24]等中分別鑒定出39、34、61、74、18和57個VQ基因。最近，在蘋果中確認了49種MdVQ蛋白[25]，且這些MdVQs在非生物脅迫（如干旱、高溫等）中發揮重要作用。【本研究切入點】何潔[26]研究表明SlVQ6極有可能參與番茄中的高溫脅迫，且通過酵母雙雜交驗證了SlVQ6能夠與SlMPK1相互作用。但對于SlVQ6的分子機理還不清楚。為了進一步研究SlVQ6的生物學功能，構建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6載體，并通過大腸桿菌表達純化，從而獲得帶有GST標簽的融合蛋白GST-SlVQ6，將其作為本研究中的誘餌蛋白，篩選出與之互作的其他蛋白。【擬解決的關鍵問題】本研究通過體外磷酸化確定SlVQ6是否是SlMPK1的底物，并通過GST pull-down技術從番茄中篩選出與SlVQ6相互作用的蛋白，通過質譜分析鑒定這些蛋白并結合生物信息學預測其功能，為進一步研究SlVQ6介導的高溫應答信號通路奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2018年在揚州大學生物科學與技術學院完成。

1.1 試驗材料

番茄種子由揚州大學生物科學與技術學院509實驗室保存；pGEX-4T-1質粒為揚州大學實驗室保存；TOP10菌株、DNA聚合酶（貨號PC12）、Arctic-Express TM表達菌購自鐘鼎生物；DNA膠回收試劑盒、純化質粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；限制性內切酶購自TaKaRa公司；0.22 μm無菌濾器和透析袋購自Millipore公司；GST親和層析膠（購自金斯瑞）。

1.2 pGEX-4T-1-PC-SlVQ6載體構建

設計的正、反向引物，提取番茄葉片cDNA，并以其作為模板，擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收，與PMD?19-T Vector連接轉化，測序驗證后，將獲得的目的基因經HⅠ和Ⅰ的酶切后，與載體pGEX-4T-1連接，從而獲得重組質粒pGEX-4T-1-PC-SlVQ6。

1.3 pGEX-4T-1-PC-SlVQ6原核蛋白的表達純化

1.3.1 轉化 將pGEX4T-1-PC-SlVQ6重組質粒轉化至大腸桿菌中培養轉化，涂板過夜培養，挑取轉化平板上的單菌落接種于含50 μg·ml-1AMP的3 ml LB培養液中，37℃ 220 r/min振搖至菌液濃度OD600為0.6—0.8。

1.3.2 IPTG誘導表達 加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·l-1，11℃ 220 r/min振搖誘導融合蛋白表達，獲得帶有GST標簽的融合蛋白GST-SlVQ6，經12% SDS-PAGE分析目標蛋白主要存在的位置后，利用GST柱對融合蛋白進行親和純化，通過低壓層析系統，將溶液上樣至GST Binding-Buffer預平衡的GST親和層析柱，并沖洗，GST Elution-Buffer（20 mmol·l-1Tris-HCl、50 mmol·l-1GSH和0.15 mol·l-1NaCl，pH8.0）洗脫目的蛋白，將收集的流出液加入透析袋中，用20 mmol·l-1Tris-HCl和0.10 mol·l-1NaCl（pH 8.0）進行透析，再次通過GST柱親和純化目標蛋白GST-SIVQ6，并進行12% SDS-PAGE分析，以確定獲得融合蛋白的純度。

1.4 SlMPK1磷酸化SIVQ6的體外驗證

將3 μg His-SlMPK1蛋白與2 μg GST-SlVQ6在激酶反應緩沖液（50 μmol·l-1ATP、[γ-32P]ATP（每個反應2 μ Ci）、25 mmol·l-1Tris-HCl pH 7.5、20 mmol·l-1MgCl2和1 mmol·l-1DTT）中混合。以GST蛋白作為陰性對照。30℃30 min，使用12%（w/v）SDS-PAGE分離蛋白質。電泳完成后切下所需凝膠，為了徹底除去游離的[γ-32P]ATP，配置50 mL 5%三氯乙酸（TCA）和1%焦磷酸鈉（NaPPi）混合液，將凝膠轉入清洗2 h（期間更換4次溶液），并對凝膠進行干燥處理，最后使用Typhoon9410 Phosphor-Imager（GE Healthcare）對凝膠成像。

1.5 篩選與SIVQ6相互作用的蛋白

挑選生長力旺盛、均勻飽滿籽粒的野生型M14番茄種子，經75%酒精、15% NaClO和無菌水消毒后，播種在滅菌的1/2MS培養基上生長。待苗長至2—3周齡時，取少許葉片迅速放入液氮中，（加提取緩沖液）放置數小時后，配置蛋白提取液，提取番茄總蛋白。將50 μg GST-SlVQ6（或GST，陰性對照）加入GST sepharose 4B beads中，并用結合緩沖液（50 mmol·l-1磷酸鈉和300 mmol·l-1氯化鈉）充分洗滌。取10 mg番茄葉粗蛋白提取物，與固定于GST sheperose 4B beads上的GST在4℃共孵育4 h后，離心取上清液，從而除去可能存在的非特異性吸附的影響。將5 mg上清液蛋白質提取物加入GST-SlVQ6包被的beads中，并在4℃孵育過夜。充分洗滌后，加入1×SDS loading buffer煮沸，通過12% SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品。將凝膠用CBB R-250染色，切下整個泳道，脫色，干燥并用胰蛋白酶消化。

質譜分析：在AB SCIEX Triple TOF 5600+LC/ MS/MS上分析胰蛋白酶消化物。通過C18柱（100 μm×3 cm，C18，3 μm，150?）進行肽分離，然后脫鹽10 min。70 min的洗脫梯度（5%—35%乙腈）用于分析型ChromXP C18色譜柱（75 μm×15 cm，C18，3 μm，120?）。通過5600系統（AB SCIEX）結合納米升噴霧Ⅲ離子源（AB SCIEX，USA）分析數據，將原始MS/MS文件數據提交至ProteinPilot TM軟件5.0（Applied Biosystems，Sciex）進行分析。使用的搜索參數設置如下：（1）樣本類型：識別鑒定；（2）消化：胰蛋白酶；（3）儀器：Triple-TOF 5600；（4）Cys烷基化：碘乙酰胺；（5）數據庫：Uniprot。

1.6 生物信息學分析

通過對GO富集與KEGG富集篩選出的與SlVQ6互作的37個蛋白進行分析。GO主要是對基因和蛋白質在分子功能、生物過程和細胞成分3個方面進行描述。KEGG PATHWAY[27]數據庫是一個代謝通路的集合，包含多個方面的分子間相互作用和反應網絡。STRING[28]是一個搜索已知蛋白與預測蛋白之間相互作用的系統。包括蛋白質之間直接的物理作用與蛋白質之間間接的功能相關性。通過STRING Version: 11.0在線軟件對蛋白互作進行驗證（https://string-db.org/）。

2 結果

2.1 構建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6載體

根據的基因序列，設計含有HⅠ和Ⅰ酶切位點的正反向引物，擴增的ORF全長編碼序列，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將測序正確的質粒雙酶切，與pGEX-4T-1-PC載體連接。通并進行雙酶切鑒定。結果顯示，得到載體DNA片段和相應的目的片段2個片段（圖1-A），與預知片段大小完全吻合，測序結果顯示重組質粒中插入的序列完全正確（圖1-B），表明pGEX-4T-1-PC-SlVQ6重組載體構建成功。

2.2 帶有GST標簽的融合蛋白GST-SIVQ6的獲得

成功獲得帶有GST標簽的融合表達載體pGEX- 4T-1-PC-SlVQ6（圖1）。首先富集誘導表達的大腸桿菌，超聲后取上清液，并進行重懸，重懸后的上清經過12%的SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍顯色后發現目標蛋白主要存在于上清液中（圖2-A）；因此，需將上清液進行親和層析純化，從而獲取目的融合蛋白。用GST柱進行親和層析純化，將最終經過透析收集到的融合蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（圖2-B），用GST-Sepharose 4B bead親合層析柱純化后可得到大量大小為54 kD的融合蛋白GST-SlVQ6。經純化獲得的GST-SIVQ6融合蛋白將被用于體外磷酸化和pull-down試驗。

A：重組質粒pGEX-4T-1-PC-SlVQ6的雙酶切鑒定，M：Marker；1：酶切前質粒；2：酶切后質粒。B：pGEX-4T-1-PC-SlVQ6的部分序列比對

A：SDS-PAGE分析Arctic Express中的表達形式，M：marker；1：未被誘導；2：誘導；3：0.5 mmol·L-1 IPTG誘導上清液；4：0.5 mmol·L-1 IPTG誘導沉淀；箭頭：GST-SlVQ6蛋白。B：融合蛋白純化的SDS-PAGE，M：marker；1：未被純化；2：流出液；3：洗脫液；箭頭：GST-SlVQ6蛋白

2.3 體外驗證SIMPK1磷酸化下游蛋白SIVQ6

前期研究通過Y2H已證明SlVQ6能夠與SlMPK1相互作用，為了進一步探索SlVQ6和SlMPK1之間的關系，將保存的His-SlMPK1和本研究獲得的GST-SlVQ6重組蛋白進行體外磷酸化試驗（圖3），結果表明，His-SlMPK1可使GST-S1VQ6磷酸化，但不能夠磷酸化GST蛋白，且GST-SlVQ6不存在自磷酸化的現象。表明SlVQ6是SlMPK1的磷酸化底物。

2.4 GST pull-down及質譜法篩選與SIVQ6相互作用的蛋白

為研究SlVQ6可能的作用機制，根據Chang等[29]研究方法對番茄細胞裂解液進行pull-down研究。提取番茄葉片總蛋白，并與帶有GST標簽的純化過后的融合蛋白GST-SlVQ6孵育，以GST-SlVQ6為誘餌蛋白（空GST為陰性對照），利用GST-SlVQ6 pull-down試驗篩選番茄葉片組織蛋白中與SlVQ6結合的蛋白（圖4-A），并經SDS-PAGE分離、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）鑒定以及Mascot與蛋白數據庫檢索，共鑒定出37個SlVQ6結合的蛋白（圖4-B和表1），包括蛋白激酶（receptor for activated C kinase 1B，RACK1B）。37個SlVQ6結合蛋白的具體信息如（表1）。

2.5 SlVQ6互作蛋白的GO富集分析

將篩選出的37個互作蛋白通過OmicsBean在線軟件進行GO富集分析，得出這些蛋白在生物過程、細胞組成、分子功能均發揮作用。其中幾乎所有的蛋白都參與細胞過程、代謝過程、細胞、細胞部分、細胞器組成以及核結合、催化活性等（圖5-A）。從富集程度最高的功能來看，在發揮分子功能的區域全部都是與核糖體的結構成分有關（圖5-B），說明與SlVQ6互作的蛋白可能介導高溫等脅迫反應。

A：His-SlMPK1和GST-SlVQ6用于帶有32P標記的磷酸化反應，GST用作陰性對照,單獨添加GST-SlVQ6證明了GST-SlVQ6的自磷酸化反應；B：內參參照考馬斯亮藍染色

表1 通過GST pull-down鑒定的37個SlVQ6特異性結合蛋白

a：ID表示擬南芥直系同源物鑒定。b：基因描述由UniProt數據庫、TIGR定義和NCBI數據庫預測

a: At ID indicatesorthologue identification;b: Gene description was predicted by UniProt database, TIGR definition and NCBI database

A：GST pull down分析與SlVQ6相互作用的蛋白質的流程圖。將GST-SlVQ6（或GST，陰性對照）添加至GST sheperose 4B beads，將番茄葉片的粗蛋白提取液添加beads，并在4℃孵育過夜。將樣品煮沸，用12% SDS-PAGE凝膠分離，回收條帶，脫色，干燥，胰蛋白酶消化，并進行LC-MS/MS分析。SBP：特異性結合蛋白；NSBP：非特異性結合蛋白。B：鑒定出37個SlVQ6特異性結合蛋白

2.6 SIVQ6互作蛋白的KEGG富集分析

通過對SlVQ6互作蛋白進行KEGG分析，發現有8個蛋白參與了核糖體通路，占比達到30%以上，超過20個蛋白參與了代謝過程，少部分蛋白參與了細胞過程（圖6-A），表明這些蛋白可能在基因遺傳過程、細胞過程、代謝方面發揮發揮重要的作用。對差異表達基因KEGG分析后顯示內質網中的蛋白過程基因富集和核糖體通路途徑富集程度最高（圖6-B）。

2.7 蛋白互作分析

通過STRING在線軟件分析SlVQ6互作蛋白，互作網絡中共有28個蛋白得到數據支持，表明試驗可靠（圖7）。圖中藍色節點為核糖體蛋白，處于整個互作網絡中最重要的位置，能夠與較多的蛋白相互作用。綠色節點和紅色節點分別代表核苷酸結合蛋白與具有氧化還原酶活性蛋白，其中HSP70和KRS-1分別能與7個和6個其他蛋白相互作用，表明這些蛋白在響應高溫等非生物脅迫過程中可能發揮著重要的作用。同時可以清晰看出SlVQ6與SlMPK1在本次分析中同樣具有相互作用，進一步支持了MAPK級聯系統參與SlVQ6介導的信號通路的結論。

3 討論

3.1 VQ蛋白通過與WRKY與MAPK互作在植物體中發揮重要作用

含有VQ基序的蛋白質（稱為VQ蛋白質）是一類具有保守和單個短FxxhVQxhTG氨基酸序列基序的植物特異性蛋白質，其中x代表任何氨基酸，h代表疏水性殘基[30]。VQ蛋白的一級結構在VQ基序以外的區域中具有高度多樣性，表明VQ蛋白具有不同的相互作用體。而植物VQ蛋白和其他生物中的蛋白序列之間具有很小的相似性，表明VQ家族對于植物是特異性的[7]。自發現第一種VQ蛋白質SIGMA FACTOR-BINDING PROTEIN1（SIB1，也稱為VQ23）以來[31]，已經對9種VQ蛋白質進行了功能鑒定，這些蛋白在植物防御反應，脅迫耐受性以及生長和發育中起著不同的作用[8]。例如，VQ23/SIB1功能喪失的植物對灰霉病菌和丁香假單胞菌的抗性均受損，而VQ23過表達株系在被病原體感染后可以減輕疾病癥狀；鈣調節蛋白結合蛋白AtCAMBP25（AtVQ15），負調節植物滲透脅迫反應[32]；AtVQ9在響應鹽脅迫時與AtWRKY8拮抗相互作用[33]。Hu等[11]先前的研究表明含有VQ基序的蛋白質（例如SIB1和SIB2）可以識別WRKY結構域的C末端并激活擬南芥中WRKY33的DNA結合活性。其次，VQ蛋白通過保守的V和Q殘基與WRKY轉錄因子相互作用而參與WRKY介導的基因表達[34]，這些結果表明植物VQ蛋白在WRKY介導的基因表達網絡中起關鍵作用[23]。通過與WRKY轉錄因子相互作用，是研究VQ蛋白家族的結構和功能最為廣泛的的方法。VQ蛋白的另一個重要特征是作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的下游底物而參與MAPK介導的信號通路，調控植物的脅迫反應及生長發育等。MAPK級聯是真核生物中的通用信號傳導模塊，并且在多種途徑中發揮作用[34]。VQ21作為MPK4的一個底物而參與MPK4介導的抗性通路。AtVQ21和WRKY33可以與AtMPK4橋接以影響植物生長和抗病性[18-19]。MPK3和/或MPK6可以磷酸化10種AtVQ蛋白，包括VQ4（MVQ1）、VQ13（MVQ2）、VQ33（MVQ3）、VQ19（MVQ4）、VQ11（MVQ5）、VQ31（MVQ6）、VQ32（MVQ7）、VQ6（MVQ8）、VQ14（MVQ9）和VQ9（MVQ10）[29]，綜上所述，VQ蛋白在多種植物體中發揮著重要的作用。

A、B：SlVQ6互作蛋白GO富集功能分析（生物過程、細胞組成和分子功能）

A：SlVQ6互作蛋白的KEGG信號通路功能分類；B：KEEG對SlVQ6互作蛋白的富集途徑統計，差異表達基因通過散點圖展示，KEEG富集程度通過富集因子、q值和富集到此通路的基因數量來衡

使用STRING工具集成了功能交互網絡模型，并將可信度參數設置為0.40閾值。藍色節點：核糖體蛋白；綠色節點：核苷酸結合；紅色節點：氧化還原酶活性

3.2 SlVQ6與SlPMK1的互作研究

Pecher等[34]研究表明AtVQ4是AtMPK6的磷酸化底物。SlVQ6與AtVQ4同源，SlMPK1與AtMPK6同源[30]。在之前的研究中，通過Y2H驗證了SlVQ6與SlMPK1的相互作用后，進一步通過體外磷酸化試驗得出SlVQ6為SlMPK1的下游底物，表明SlVQ6可能在SlMPK1介導的信號通路中起到關鍵作用[26]，為研究VQ6在番茄高溫脅迫反應提供了強有力的支持。

3.3 SlVQ6與37個互作蛋白的鑒定

SlVQ6因其在不同組織中的最高表達水平引起注意[5]。SlVQ6與AtVQ4（MVQ1）同源，MVQ1以VQ-基序依賴性方式抑制PAMP誘導的基因表達，充當PAMP誘導對病原體的抗性的反應的負調節因子[30]。在番茄中，SlVQ6在所有組織中均有表達，其中紅色果實中的表達水平最高，而綠色果實中的表達水平最低[5]。已知SlVQ6可以響應鹽，干旱和寒冷脅迫等。然而，SlVQ6的具體功能仍不清楚。為了研究SlVQ6的可能作用機制，本研究進行了pull down研究，通過LC-MS/MS鑒定了37個SIVQ6相互作用蛋白（圖4-B）。由于SlVQ6和SlMPK1之間已知的相互作用，將SlMPK1添加到由STRING構建的蛋白質網絡中。有趣的是，SlMPK1是SIVQ6與其他蛋白質之間的聯系紐帶，該網絡表明SlVQ6在基因轉錄和翻譯中的重要性（圖7）。本研究鑒定出蛋白激酶RACK1B（Solyc12g040510），它能夠與SlVQ6相互作用。擬南芥中的、和編碼的活化C激酶1（RACK1）蛋白的受體充當MAPK支架蛋白并將MPK3/MPK6級聯連接至上游異源三聚體G蛋白信號傳導，AtVQ12與RACK1C相互作用[35]。此外，還報道了AtVQ8與RACK1C相互作用[7]。因此，本研究推測RACK1蛋白與SlVQ6之間存在相互作用，MPK6可能參與這種相互作用。還不確定番茄中RACK1和SlMPK1之間是否存在直接相互作用。迄今為止，已經鑒定SlVQ6的37個不同的相互作用蛋白，它們互作機制和生理功能仍需要進一步研究。

4 結論

SlVQ6是番茄VQ蛋白家族中一個重要的蛋白，通過蛋白表達純化獲得帶有GST標簽的GST-SlVQ6融合蛋白，進而由體外磷酸化得出SlVQ6作為SlMPK1的下游底物而參與番茄中的信號通路。GST pull-down及LC-MS/MS技術從番茄中篩選出37個與SlVQ6互作的蛋白，這些蛋白參與不同的代謝通路及分子功能，可能在響應高溫等脅迫反應中發揮著重要的作用。

[1] MITTLER R, FINKA A, GOLOUBINOFF P. How do plants feel the heat?, 2012, 37: 118-125.

[2] BOKSZCZANIN K L, FRAGKOSTEFANAKIS S, BOSTAN H. Perspectives on deciphering mechanisms underlying plant heat stress response and thermotolerance., 2013, 4: 315.

[3] DINAR M, RUDICH J. Effect of heat stress on assimilate metabolism in tomato flower buds., 1985, 56(2): 249-257.

[4] PRESSMAN E, PEET M, PHARR M. The effect of heat stress on tomato pollen characteristics is associated with changes in carbohydrate concentration in the developing anthers., 2002, 90(5): 631-636.

[5] Ding H D, Yuan G B, Mo S R, Qian Y, WU Y, CHEN Q, XU X Y, WU X X, GE C L. Genome-wide analysis of the plant-specific VQ motif-containing proteins in tomato () and characterization of SlVQ6 in thermotolerance., 2019, 143: 29-39.

[6] Xie Y D, Li W, Guo D, DONG J, ZHANG Q, FU Y, REN D, PENG M, XIA Y. Thegene SIGMA FACTOR-BINDING PROTEIN 1 plays a role in the salicylate- and jasmonate-mediated defence responses., 2010, 33: 828-839.

[7] CHENG Y, ZHOU Y, YANG Y, CHI Y J, ZHOU J, CHEN J Y, WANG F, FAN B F, SHI K, ZHOU Y H, YU J Q, CHEN Z X. Structural and functional analysis of VQ motif containing proteins inas interacting proteins of WRKY transcription factors., 2012, 159: 810-825.

[8] JING Y J, LIN R C. The VQ motif-containing protein family of plant-specific transcriptional regulators., 2015, 169: 371-378.

[9] KLAUS P, QIU J L, JURY L, BERTHE K F, SIDSEL H, JOHN M, MORTEN P.MKS1 is involved in basal immunity and requires an intact N-terminal domain for proper function., 2010, 5: e14364.

[10] WANG A H, DAMIEN G, ZHANG H Y, FENG K, ABED C, FRED B, WILLIAM J P, ELIZABETH S D, LUO M. The VQ motif protein IKU1 regulates endosperm growth and seed size in., 2010, 63: 670-679.

[11] LAI Z B, LI Y, WANG F, CHENG Y, FAN B F, YU J Q, CEHN Z X.sigma factor binding proteins are activators of the WRKY33 transcription factor in plant defense., 2011, 23: 3824-3841.

[12] HU P, ZHOU W, CHENG Z W, FAN M, WANG L, XIE D X. JAV1 controls jasmonate-regulated plant defense., 2013, 50: 504-515.

[13] LI Y L, JING Y J, LI J J, XU G, LIN R C.VQ MOTIF-CON-TAINING PROTEIN29 represses seedling deetiolation by interacting with PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR1., 2014, 164: 2068-2080.

[14] PAN J J, WANG H P, HU Y R, YU D Q.VQ18 and VQ26 proteins interact with ABI5 transcription factor to negatively modulate ABA response during seed germination., 2018, 95: 529-544.

[15] WANG H P, HU Y R, PAN J J, YU D Q.VQ motif-containing proteins VQ12 and VQ29 negatively modulate basal defense against., 2015, 5: 14185.

[16] MARTIN W, LENNARD E, PASCAL P. Ménage à trois the complex relationships between mitogen-activated protein kinases, WRKY transcription factors, and VQ-motif-containing proteins., 2014, 9(8): e29519.

[17] LEI R H, LI X L, MA Z B, LV Y, HU Y R, YU D Q.WRKY2 and WRKY34 transcription factors interact with VQ20 protein to modulate pollen development and function., 2017, 91: 962-976.

[18] QIU J L, FIIL B K, PETERSEN K, NIELSEN H B, BOTANGA C J, THORGRIMSEN S, PALMA K, SUAREZ R M C, SANDBECH C S, LICHOTA J, QIU J L, FIIL B K, PEETRSEN K.MAP kinase 4 regulates gene expression through transcription factor release in the nucleus., 2008, 27: 2214-2221.

[19] GARGUL J M, MIBUS H, SEREK M. Manipulation of MKS1 gene expression affectsandphenotypes., 2015, 13: 51-61.

[20] KIM D Y, KWON S I, CHOI C. Expression analysis of rice VQ genes in response to biotic and abiotic stresses., 2013, 529: 208-214.

[21] SONG W B, ZHAO H M, ZHANG X B, LEI L, LAI J S. Genome-wide identification of VQ motif-containing proteins and their expression profiles under abiotic stresses in maize., 2016, 6: 1177.

[22] WANG X B, ZHANG H W, SUN G L, JIN Y, QIU L J. Identification of active VQ motif-containing genes and the expression patterns under low nitrogen treatment in soybean., 2014, 543(2): 237-243.

[23] WANG M, VANNOZZI A, WANG G, ZHONG Y, CORSO M, CAVALLINI E, CHENG Z M. A comprehensive survey of the grapevine VQ gene family and its transcriptional correlation with WRKY proteins., 2015, 6: 417.

[24] ZHANG G Y, WANG F D, LI J J, DING Q, ZHANG Y H, LI H Y, ZHANG J N, GAO J W. Genome-wide identification and analysis of the VQ motif- containing protein family in Chinese cabbage (L. ssp. Pekinensis)., 2015, 16(12): 28683-28704.

[25] DONG Q L, ZHAO S, DUAN D Y, TIAN Y, WANG Y P, MAO K, ZHOU Z S, MA F W. Structural and functional analyses of genes encoding VQ proteins in apple., 2018, 272: 208-219.

[26] 何潔. 番茄SlMPK1的互作蛋白篩選及初步功能分析[D]. 揚州: 揚州大學, 2016.

He J. Screening and preliminary functional analysis of interaction proteins of tomato SlMPK1[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2016. (in Chinese)

[27] KANEHISA M, SATO Y, FURUMICHI M, MORISHIMA K, TANABE M. New approach for understanding genome variations in KEGG., 2018, 47: 590-595.

[28] Szklarczyk D, Morris J H, Cook H, Kuhn M, Wyder S, Simonovic M, Santos A, Doncheva N T, Roth A, Bork P, Jensen L J, VON M C. The STRING database in 2017: quality- controlled protein-protein association networks, made broadly accessible., 2017, 45(D1): D362-D368.

[29] CHANG S J, HSIAO J C, SONNBERG S. Poxvirus host range protein CP77 Contains an F-Box-like domain that is necessary to suppress NF-κB activation by tumor necrosis factor alpha but is independent of its host range function., 2009, 83(9): 4140-4152.

[30] DING H D, HE J, WU Y, WU X X, GE C L, WANG Y J, ZHONG S L, PEITER E, LIANG J S, XU W F. The tomato mitogen-activated protein kinase SlMPK1 is as a negative regulator of the high temperature stress response., 2018,177(2): 633-651

[31] MORIKAWA K, SHIINA T, MURAKAMI S, TOYOSHIMA Y. Novel nuclear encoded proteins interacting with a plastid sigma factor, Sig1, in., 2002, 514: 300-304.

[32] PERRUC E, CHARPENTEAU M, RAMIREZ B C, JAUNEAU A, GALAUD J P, RAOUL R, RANTY B. A novel calmodulin-binding protein functions as a negative regulator of osmotic stress tolerance inseedlings., 2004, 38: 410-420.

[33] HU Y R, CHEN L G, WANG H P, ZHANG L P, WANG F, YU D Q.transcription factor WRKY8 function agonistically with its interacting partner VQ9 to modulates salinity stress tolerance., 2013, 74(5): 730-745.

[34] PECHER P, ESCHENLIPPOLD L, HERKLOTZ S. Themitogen-activated protein kinases MPK3 and MPK6 target a subclass of 'VQ-motif'-containing proteins to regulate immune responses., 2014, 203(2): 592-606.

[35] ISLAS-FLORES T, RAHMAN A, ULLAH H, VILLANUEVA M A. The receptor for activated C kinase in plant signaling: tale of a promiscuous little molecule., 2015, 6: 1090.

Screening of Interacting Protein of Tomato SIVQ6 by GST Pull-down

YUAN GuiBo, MO ShuangRong, QIAN Ying, ZANG DongNan, YANG Fan, JIANG HongLiang, WU Yuan, DING HaiDong

(college of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu)

【】The VQ motif-containing (VQ) proteins are plant-specific proteins with a conserved “FxxhVQxhTG” amino acid sequence, which regulate plant growth and development. SlMPK1 plays an important role in the process of high temperature stress, but its downstream target proteins are poorly understood. Although yeast double hybridization (Y2H) showed that SlVQ6 protein could interact with SlMPK1, there was no further experimental evidence. Therefore, it is especially important to verify the interaction between SlMPK1 and SlVQ6 and to study the interaction network of SIVQ6. 【】First, pGEX-4T-1-PC-VQ6 plasmid was constructed. Through design of specific primers based on thegene sequence, and using the plasmid containing the target gene SIVQ6 as a template to amplify the target gene sequence, the obtained target genewas cloned between the restriction sites ofHⅠ andⅠ of the vector pGEX-4T-1, and the pGEX-4T-1-PC-VQ6 was transferred into a TOP10 clone strain. The target protein PC-VQ6 was obtained by IPTG (isopropyl thiogalactoside) inducing expression and the expected GST-SlVQ6 fusion protein was obtained by affinity purification by GST column. Phosphorylation was performedto further determine whether SlVQ6 is the substrate of SlMPK1. GST-SlVQ6 was used as the bait protein to fix on GST Sepharose Beads and incubated with tomato leaf total protein, and then the incubated fusion material was eluated. The eluate was collected and verified by SDS-PAGE gel electrophoresis. LC-MS/MS was used to detect the candidate proteins that could interact with SlVQ6, and the screened SIVQ6 interacting proteins were used for bioinformatics analysis by GO, KEGG, and protein interaction networks. 【】The results showed that we successfully constructed the recombinant gene expression plasmid pGEX4T-1-PC-SlVQ6 and obtained the GST-SlVQ6 fusion protein with a GST tag, of which the molecular weight is about 54 kD. GST-SlVQ6 and His-SlMPK1 were subjected to phosphorylation experiments. SlVQ6 could be phosphorylated by SlMPK1, however the GST could not be phosphorylated by SlMPK1 as a negative control and there was no autophosphorylation phenomenon in SlVQ6, indicating that SlVQ6 has an interaction with SlMPK1, and SlVQ6 is a downstream substrate of SlMPK1. GST-SlVQ6 fusion protein was used as bait protein (GST as negative control), and the protein bound to SlVQ6 protein in tomato leaf tissue protein was screened by pull-down test. Through SDS-PAGE, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) identification, and Mascot protein database search, 37 SlVQ6-bound proteins were identified, including protein kinase Receptor for Activated C Kinase 1B (RACK1B). Bioinformatics analysis of GO, KEGG, and protein interaction networks indicated that these proteins are involved in a variety of signaling pathways, and eight of the ribosomal proteins may be closely related to high temperature stress. 【】This research shows that SlVQ6 is a substrate protein of SlMPK1 and 37 proteins may interact with SlVQ6. These proteins are closely related to the stress response and may play an important role in the high temperature tolerance of tomato plants.

tomato; SlVQ6; SlMPK1; pull-down; interaction protein

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.014

2019-10-17；

2020-01-29

國家自然科學基金（31101092）、江蘇省自然科學基金（BK20191437）、揚州大學大學生科創基金（X20180673，X20180674和X20190706）

原貴波，E-mail：1076416981@qq.com。通信作者丁海東，E-mail：hdding@yzu.edu.cn

（責任編輯 李莉）