木瓜SOD的提取及其活性測定方法的優化

郭善軍 陳章寶

摘 ?要：目的 ?建立能準確測定木瓜超氧化物岐化酶（SOD）活性的測定方法。方法 ?采用單因素試驗分析法，通過探究鄰苯三酚自氧化反應體系的最大吸收波長、測定時間段、緩沖液pH值、鄰苯三酚濃度和反應溫度對自氧化速率的影響，建立了測定木瓜SOD活性的鄰苯三酚自氧化法最佳應用體系;通過建立的木瓜SOD活性檢測方法優化木瓜SOD提取條件。結果 ?鄰苯三酚自氧化法最佳測定條件為：檢測波長319nm，測定時間范圍3.5min，緩沖液pH8.20，反應溫度25℃，鄰苯三酚濃度4.5mmol/L。木瓜SOD最佳提取工藝為：pH6.8的磷酸鹽緩沖液、超聲功率600W、超聲時間20min浸提木瓜SOD，丙酮分級沉淀法純化木瓜中的SOD，最終所得SOD用鄰苯三酚自氧化法測定活性為529.72U/mg。結論 ?建立了能準確測定木瓜SOD活性的檢測方法，并篩選得到木瓜最佳SOD提取條件。

關鍵詞：超氧化物岐化酶 ?鄰苯三酚自氧化法 ?提取方法優化

中圖分類號：TS20 ? 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2020）06（c）-0066-03

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，簡稱SOD）是一種廣泛存在于自然界各種生物體內的酸性蛋白，自從1969年，超氧化物岐化酶首次被Fridovich和McCord[1]從牛紅細胞中分離出來，發現其是一種重要的自由基清除劑，對治療因超氧游離基引起的各種疾病都有一定的療效，臨床可作為抗老化、抗炎癥、自身免疫疾病的治療藥品。

1 ?材料和方法

1.1 材料

鮮木瓜購買于重慶市綦江縣三角鎮木瓜海棠園。

1.2 方法

1.2.1 鄰苯三酚自氧化法的建立

具體情況見表1。

1.2.2 影響SOD活性測定的因素

將質量濃度為258μg/mL SOD標準液，分別于37℃、60℃、100℃條件下，加熱處理0min、3min、5min、20min、60min，邊加熱邊用玻璃棒輕輕攪拌，加熱完成后，迅速放入冰水混合物中冷卻30min，然后分別取不同溫度下各時間段的SOD溶液，加入到SOD檢測體系中進行測定。

1.2.3 SOD提取及其工藝優化

（1）稱取20g的新鮮木瓜，用榨汁機使其組織破碎，加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液40mL，攪拌浸提過夜，用紗布濾去粗大的纖維物質，5000rpm，4℃，離心10min，去除多糖和其他不溶雜質。

（2）粗提液于0℃低溫循環水溶超聲處理，輔助木瓜SOD提取，5000rpm，4℃，離心10min得到提取液。

（3）提取液中加入10mL氯仿-乙醇（V氯仿∶V乙醇=3∶5）混合液作為萃取劑，攪拌過夜，5000rpm，4℃，離心10min，取上清，得粗酶液。

（4）將所得粗酶液于60℃恒溫水浴熱擊20min除雜蛋白，立即流水浴冷卻至室溫，5000rpm，4℃，離心20min，除去沉淀雜蛋白。

（5）采用硫酸銨鹽析法，向（4）中所得上清液中加入（NH4）2SO4至45%飽和濃度，攪拌過夜后，5000rpm，4℃，離心20min;取上清加入（NH4）2SO4至90%飽和度，攪拌過夜后，5000rpm，4℃，離心20min得到沉淀，0.2mol/L磷酸鹽緩沖液溶解，透析24h，取樣加入到SOD檢測體系中進行測定。

2 ?結果與分析

2.1 鄰苯三酚自氧化法的建立

2.1.1 鄰苯三酚自氧化最大吸收波長的選取

由圖1可以看出，4min內鄰苯三酚自氧化產物的最大吸收峰為319nm，而在325nm、420nm處基本無吸收峰出現。與文獻報道的最大吸收峰420nm和325nm有一定差異。因峰的靈敏度和準確度，該試驗選擇波長319nm進行測定。

2.1.2 鄰苯三酚自氧化測定時間范圍的選取

如圖2所示，為了準確測定鄰苯三酚自氧化速率，該試驗選取30～210s即3min時間段內直線斜率來表示鄰苯三酚的自氧化速率△A0。

2.1.3 pH對鄰苯三酚自氧化速率的影響

如圖3所示，鄰苯三酚自氧化速率在堿性條件下隨pH的升高而增大，并且斜率逐漸增大，這可能與pH增大時鄰苯三酚的酚羥基中H+更易解離，形成的帶電基團能量較高、不穩定，而易被氧化有關。因此，綜合考慮諸因素的影響，該試驗選擇pH8.2作為緩沖溶液適宜的pH值。

2.1.4 鄰苯三酚濃度對自氧化速率的影響

如圖4所示，鄰苯三酚自氧化速率隨其濃度的升高而增大，兩者呈線性關系，且鄰苯三酚自氧化進程的吸光度值與時間的線性關系，隨其濃度的升高而降低。因此，該試驗選用鄰苯三酚的濃度為4.5mmol/L。

2.2 影響SOD活性測定的因素分析

2.2.1 SOD活性測定范圍的選擇

鄰苯三酚自氧化抑制率在15%～60%之間時，SOD濃度與自氧化抑制率間基本呈正比關系。因此，測定樣品SOD活性時，調節樣品濃度，選取百分抑制率在50%左右的樣品濃度，此時測定的準確度和靈敏度最佳。

2.2.2 SOD熱穩定性試驗

由圖5可知，標準SOD在37℃和60℃下加熱1h，SOD活性略有降低，但總體變化不大，說明SOD活性在37℃～60℃范圍內比較穩定。而SOD標準品在100℃下加熱失活后，依然能夠檢測出SOD活力，且活力在1h時反向增大，說明失活的SOD蛋白對檢測體系仍會造成干擾。因此，該試驗選擇在60℃水浴20min，加熱去除雜蛋白。

2.2.3 維生素C對SOD檢測體系的影響

從表2結果說明，維生素C是對SOD檢測體系構成干擾的小分子物質，木瓜中含有較多的維生素C可影響SOD活性的檢測。因此，該試驗后續將通過透析24h，排除VC對SOD檢測體系造成的影響。

2.3 木瓜SOD提取工藝優化

2.3.1 提取溶劑的篩選

從表3可以看出，pH6.8磷酸鹽緩沖液的提取液酶活性最高。因此，pH6.8的磷酸鹽緩沖液提取木瓜SOD提取效果最好。

2.3.2 超聲萃取功率的篩選

由超聲功率篩選結果可知（見表4），隨著超聲功率的提高，木瓜SOD提取率明顯增加。但超聲功率過高，SOD活性反而有所下降。這可能是由于超聲功率過高引起了酶蛋白的空間結構發生變化。綜合考慮，該試驗選擇600W超聲功率為SOD提取的最佳功率。

2.3.3 木瓜中SOD的提取

木瓜通過提取純化后，采用鄰苯三酚自氧化法測定木瓜中SOD活性分別為529.72U/mgprot，說明篩選得到的木瓜SOD提取條件穩定、可行。

3 ?結語

該試驗采用單因素試驗分析法探究鄰苯三酚自氧化反應體系的檢測條件，建立了鄰苯三酚自氧化法最佳應用體系。試驗證明，該體系測定結果穩定且準確。利用建立的鄰苯三酚自氧化法篩選木瓜SOD最佳提取條件的篩選，得到木瓜SOD提取的最佳條件，為將來開發利用木瓜內SOD提供了基礎。

參考文獻

[1] McCord J，Waugh TA，Ritchie J M. Overexpression of manganese or copperzinc superzinc superoxide dismutase inhibits breast cancer growth[J].Free Radic Biol Med，2006，419（2）：226-237.

[2] 金紹黑.植物超氧化物歧化酶的提取、修飾制備工藝及其應用研究[J].成都航空職燃學院學報，2005，21（1）：44.

[3] 許雅娟，趙艷景，胡虹.鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的研究[J].西南民族大學學報：自然科學版，2006，32（6）：1208-1212.