分子印跡技術在藥物分析中的應用

李春蘭(武威職業學院，甘肅 武威 733000)

0 引言

分子印跡技術與人工合成分子識別系統和生物識別系統具有一定的相似性，通過對分子印跡聚合物進行制備，從而可以實現分子鍵合強度和選擇特異性。分子印跡聚合物在藥物分離分析、固相萃取等方面得到廣泛的應用。

1 分子印跡的原理及方法

分子印跡技術是將目標分子作為模板通過功能匹配的方式，結合共價非共價與模板分子的共同結合，形成單一模板復合物復合物。在交聯劑的作用下，可以產生聚合反應，聚合物可以洗去模板分子，與模板分子的空間結構進行結合，形成特異性特征，使分子產生較強的吸附性。

1.1 共價印跡法

模板分子與功能單體從過結合的方式，形成結構非常穩定的分子，但是此類方法制備過程比較復雜，模板分子很難脫離出來。回收利用的環節中，很難達到熱力學平衡。

1.2 非共價印跡法

此類方法與共價印跡方法相比，模板分子與功能單體通過氫鍵和疏水的作用下形成共價鍵的結合。氫鍵應用非常多，其合成方法非常簡單，操作方式更加靈活。氫鍵的作用形成比較弱，因此模板分子非常容易清洗與脫落，提升其適用性。然而其結合位點作用強度存在一定的差異，導致非特異性吸附產生。

1.3 準共價印跡法

準共價印跡法是將共價法與非共價法結合起來，通過模板分子與功能單體的結合，形成選擇性強的方法，這種方法的適用性非常廣泛。

1.4 金屬離子印跡法

金屬離子印跡法主要采用氧原子和鈉原子配位的方式形成電子分子，復合物的穩定性非常高。

2 分子印跡技術在藥物分析中的應用

2.1 手性拆分

在手性分子分離技術進行研究中，主要分析消旋體的生物活性。與傳統的色譜法比較來說，分子印跡技術可以有效的避免手性固相法價格高昂、容易污染的局限性，而且分子印跡技術的手性流動相選擇比較小。

2.2 分子印跡傳感器

分子印跡傳感器具有非常強的選擇性，并且靈敏度高，在藥物分析中得到廣泛應用。結合模板分子，將鄰氨基酚作為功能單體，從而制作印跡膜電化學傳感器。

2.3 表面印跡聚合應用

2.3.1 材料

掃描電鏡(99.9%)購自遠野(上海)有限公司，偶氮二異丁腈(AIBN)。亞甲基琥珀酸是從天津天力化學試劑有限公司獲得的。乙烯二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、甲基丙烯酸(MAA)、辣根過氧化物酶(HRP)由Sigma Aldrich(美國密蘇里州圣路易斯)提供。氯化鉀、醋酸鈉、醋酸和氫氧化鈉均購自國家集團化學試劑公司。

2.3.2 溶劑

磷酸鹽緩沖鹽(PBS)-0.1M磷酸鹽緩沖鹽(pH7.4)。

PBS-T-含0.05%吐溫-20的PBS緩沖液。

TMB基質溶液-在250μL二甲基亞砜中添加3.3mg TMB到25mL含3.25μL 30%H2O2溶液的檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH4.3)中。

1.25M H2SO4溶液。

2.3.3 實驗中用到的設備

采用使用掃描電子顯微鏡(日本東京日立高科技公司)觀察MIP的表面形貌。采用傅立葉變換紅外光譜法(FTIR)，用多光譜微型板分光光度計(美國加州熱科學儀器有限公司)、SHA-B恒溫振蕩器(上海武友有限公司)測定免疫測定吸光度。

2.3.4 計算模型

利用Gaussian 09軟件開發了基于DFT和交換相關函數(M062X)的計算建模方法，用于計算掃描電鏡與不同功能單體之間的結合能(ΔE)。分析了SEM與不同功能單體配合物的三維結構、鍵長和鍵角。根據公式(1)計算ΔE：

式中：Ec為絡合物的能量；Et和Em分別為模板和單體的勢能。

2.3.5 溶液體系中模板分子和功能單體的光譜分析

以甲醇-乙腈(1:1，v/v)為溶劑，模板分子SEMs與功能MAA單體的比例分別為1:0、1:2、1:4、1:6和1:8。將混合溶液在恒溫水浴中振蕩12h，以相應濃度的功能性單體溶液為參考，測定其紫外吸收光譜，并研究其波長位移。

甲醇-乙腈(1:1，v/v)用作溶劑。制備20mM SEM溶液和200mM MAA溶液，按5:2比例混合，以甲醇/乙腈(1:1，v/v)為對照進行FTIR分析和比較。通過分析SEM與MAA鍵合前后光譜中基團拉伸振動峰的變化，可以判斷SEM與MAA鍵合反應。

2.3.6 MIP膜的制備

MIP的制備環節中，首先，將0.2mmol的掃描電鏡和0.8mmol的甲基丙烯酸甲酯分別置于16mL乙腈/甲醇(1:1，v/v)中，37℃磁力攪拌1h，依次加入2.4mmol的EGDMA和20mg的AIBN，37℃磁力攪拌1h，將混合液加入96孔微量滴定板中，200μL/孔，將微量滴定板置于密封的容器中充滿氮氣的袋子，在37℃下聚合24h。

聚合后，在甲醇-醋酸洗脫液(9:1，v/v)中超聲洗脫微量板，每2h更換一次洗脫液，直到不再含有SEM(12h)。然后將微量滴定板在甲醇溶液中洗滌2h以除去醋酸，并在37℃干燥2h。作為對照，NIP(非分子印跡聚合物)的制備與MIP相同，但沒有SEM。

用掃描電子顯微鏡觀察MIP和NIP的表面形貌，比較兩者的差異，掃描電子顯微鏡的步驟如下：將樣品(100μg)用導電膠帶固定在圓柱形支架上，然后在10kV的加速電壓下進行真空鍍金。在觀察之前，樣品在10mA下用金濺射30s。觀察時間應盡可能短，以避免電子束長期照射造成的電子損傷。

將不同濃度(10～100mg/L)的掃描電鏡標準溶液(200μL)加入制備的MIP微量滴定板的每個孔中。在25℃的搖瓶機上以500rpm搖板1h，用HPLC-MS/MS測定SEM濃度，根據吸附前后SEM濃度的變化，計算MIPs對SEM的吸附能力。作為對照，NIP處理與MIP相同。

將掃描電鏡溶液(20mg/L)以200μL/孔的速度加入到MIP微量滴定板中。將微量滴定板置于25℃的軌道振動篩上，在25℃下振動(500r/min)不同時間(5、10、20、30、40、50、60、80和100min)。在不同時間，測定溶液中未吸附的掃描電鏡的含量。計算了MIP的吸附容量，并繪制了吸附動力學曲線。

吸附容量(Q)按式(2)計算：

式中：Q為吸附量(μg/孔)；C0為SEM的初始濃度(μg/mL)；C為吸附后上清液中SEM的濃度(μg/mL)；V為每孔加入標準溶液的體積(mL)。

2.3.7 酶標抗原的制備

將5mg HRP溶解在1mL去離子水中，然后添加0.2mL 0.1M NaIO4。將混合物在37℃下攪拌20min，滴入0.2mL乙二醇并攪拌30min。在4℃下用1M醋酸鈉緩沖液透析過夜后，添加2mL 5mg/mL掃描電鏡溶液，并將pH值調整至9.5。然后在黑暗中將混合物攪拌1h，添加0.1mL 4mg/mL NaBH4，在4℃下放置2h，并在0.1M PBS緩沖液(pH=7.4)中透析3d。加入等量的甘油，然后將制劑儲存在-20℃下，制備的藥物標記抗原濃度為5mg/mL。

先將1g/L的掃描電鏡原液稀釋至不同濃度(10000、1000、100、10和1ng/mL)。將這些掃描電鏡標準溶液加入到MIP微量滴定板(100μL/孔)中，并將1:800稀釋比(100μL/孔)的掃描電鏡-HRP溶液加入到同一孔中。同時建立對照井和空白井。以1:800稀釋比填充100μL PBST和100μL SEM HRP溶液，空白井填充200μL PBST。將微量滴定板放在滾動混合器上2min，在37℃下孵育1h，然后丟棄微量滴定板中的溶液，每3min用PBST清洗5次，并拍打在干凈的濾紙上干燥。

將制備好的底物溶液(150μL)添加到每個孔中，并在37℃下孵育30 min。然后將每個孔中的溶液轉移到新的微量滴定板的相應孔中，并且通過每個孔添加50μL 1.25M H2SO4溶液來終止反應。然后，在450nm處用多光譜微板分光光度計測定OD值。以SEM濃度為橫坐標(x)，按公式計算相應濃度的抑制率，以濃度為縱坐標(y)繪制抑制濃度曲線。

2.3.8 樣品制備和方法驗證

使用大約2g藥品進行均質化，然后，將均勻的樣品裝入50mL離心管中，分別加入1、10和20μg/kg的掃描電鏡溶液，然后加入7.5mL去離子水和0.5mL 1M鹽酸。然后將該混合物徹底渦流混合30s，將pH值調整為7.5，渦流混合5min后，加入10mL乙酸乙酯。將混合物置于25℃下20min。然后，將樣品在2400g下于25℃下離心10min。收集乙酸乙酯層并在40℃下于氮氣流下干燥。用2mL甲醇PBS溶液(1:1，v/v)將殘渣重組，在2400g下離心10min。收集下層進行以下BELISA分析。

采用掃描電鏡(SEM)標準加入法，對BELISA法的準確度和適用性進行了評價。此外，我們采用傳統的ELISA和HPLCMS/MS方法對實際藥物樣品進行了掃描電鏡分析，并與已有方法進行了比較。

3 結語

近年來，分子印跡技術發展非常迅速，結合仿生傳感器和納米印跡技術，在藥物分析中得到廣泛的應用。因此，在藥物分析中，應該充分結合分子印跡技術的優勢，有效的克服傳統手動印跡的局限性。