葡萄鉀離子通道基因VviSKOR的克隆、表達(dá)及電生理功能

沈靜沅，唐美玲，楊慶山,3，高雅超，劉萬好,，程杰山，張洪霞，宋志忠,4

葡萄鉀離子通道基因的克隆、表達(dá)及電生理功能

沈靜沅1，唐美玲2，楊慶山1,3，高雅超1，劉萬好1,2，程杰山1，張洪霞1，宋志忠1,4

（1魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院/山東省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“作物高產(chǎn)抗逆分子模塊育種實(shí)驗(yàn)室”，中國山東煙臺(tái) 264000；2煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究所， 中國山東煙臺(tái) 264000；3山東省林業(yè)科學(xué)研究院，中國濟(jì)南 250014；4劍橋大學(xué)植物系，英國劍橋 CB2 3EA）

【】從葡萄中克隆并鑒定鉀離子通道基因，在轉(zhuǎn)錄水平分析其組織特異性表達(dá)特征及對(duì)缺鉀、氯化鈉（NaCl）與脫落酸（ABA）等脅迫的響應(yīng)情況，通過膜片鉗電生理技術(shù)研究其生理學(xué)功能。通過同源克隆法，在葡萄基因組中篩選并鑒定鉀離子通道基因；借助多種生物信息學(xué)軟件分析葡萄及其編碼蛋白的特征；利用MEGA 7.0軟件建立葡萄、擬南芥、水稻、玉米、高粱、短柄草、大豆、番茄、黃瓜、白楊、桃、梨、草莓、蘋果、木瓜、柑橘、香蕉、鳳梨等18種不同科屬植物SKOR同源蛋白成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在葡萄不同組織部位的表達(dá)模式及對(duì)缺鉀、NaCl、ABA與sorbitol等脅迫的響應(yīng)情況；利用膜片鉗電生理系統(tǒng)分析葡萄的生理學(xué)功能。在葡萄基因組中克隆獲得一個(gè)鉀離子通道基因，其編碼蛋白含有環(huán)核苷酸結(jié)合域、離子通道跨膜域、Ankyrin repeats和KHA功能結(jié)構(gòu)域，屬于典型的Shaker類鉀離子通道；18種不同科屬植物SKOR蛋白在氨基酸水平具有58.92%的一致性，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明葡萄VviSKOR與黃瓜CsaSKOR緊密聚在一起，其遺傳進(jìn)化關(guān)系上較近，4種禾本科植物（玉米、水稻、短柄草和高粱）SKOR家族成員在系統(tǒng)進(jìn)化樹上更傾向于聚在一起，而同屬薔薇科植物（草莓、蘋果、梨和桃）SKOR在進(jìn)化關(guān)系上緊密聚在一起；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明葡萄VviSKOR蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜，且含有6個(gè)跨膜區(qū)，其等電點(diǎn)PI為6.24，表明該蛋白含有偏酸性氨基酸殘基較多；在啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)到12種順式作用元件，主要包括脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)和細(xì)胞周期調(diào)控等不同生命活動(dòng)相關(guān)的調(diào)控元件；數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜分析結(jié)果表明葡萄在多種組織或器官中均有表達(dá)，在葡萄樹根中的表達(dá)水平最高，其次是葉和木質(zhì)部；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明在7年生‘馬瑟蘭’葡萄樹根部和幼苗根部的表達(dá)水平均最高；幼苗中，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)高鉀處理沒有響應(yīng)，但對(duì)缺鉀、ABA和NaCl脅迫處理較為敏感，其在檢測(cè)幼苗根部、莖部和葉片中的表達(dá)量均被缺鉀和ABA抑制而降低，卻受NaCl脅迫誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染pTracer-CMV3-質(zhì)粒的HEK293-T細(xì)胞記錄到外向電流，且隨細(xì)胞外鉀離子濃度的增加而降低，表明VviSKOR為一外流型鉀離子通道，此外，記錄到的電流隨著電壓的增加而增加，說明VviSKOR也是電壓依賴型鉀離子通道。葡萄VviSKOR與黃瓜CsaSKOR在遺傳進(jìn)化關(guān)系上最為相近；主要在葡萄根部（成年樹和幼苗）表達(dá)，幼苗中在轉(zhuǎn)錄水平受缺鉀、ABA和NaCl脅迫的調(diào)控；VviSKOR是葡萄根部主導(dǎo)鉀離子外排的鉀離子通道。

葡萄；Shaker類鉀離子通道；SKOR；基因克隆與表達(dá)；膜片鉗技術(shù)

0 引言

【研究意義】鉀離子（K+）是作物生長發(fā)育所必需的關(guān)鍵礦質(zhì)營養(yǎng)元素[1-3]。植物為了滿足正常生長，需要通過根部從土壤中有效地吸收所需的鉀素，然后分配到不同器官部位，或者在某些組織富集積累[4-7]。編碼一類外向整流型Shaker類鉀離子通道，負(fù)責(zé)將韌皮部的K+分泌至木質(zhì)部，介導(dǎo)K+向根系輸導(dǎo)組織的釋放，屬于典型的電壓依賴型鉀外排過程，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用[4,8]。近20年來，模式作物擬南芥中SKOR通道生理功能的分子機(jī)制研究較為詳盡。然而，果樹中Shaker類鉀離子通道的功能依然未知，有關(guān)SKOR蛋白的研究仍然空白。【前人研究進(jìn)展】鉀離子是植物細(xì)胞中最為重要的金屬元素之一，參與信號(hào)傳導(dǎo)、氣孔運(yùn)動(dòng)、光合作用、蒸騰作用和脅迫抗逆等生命過程，是作物生長發(fā)育所必需的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，缺鉀不僅會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降，同時(shí)也會(huì)影響作物品質(zhì)[1-2,7-8]。植物鉀吸收動(dòng)力學(xué)研究表明植物鉀營養(yǎng)吸收存在2種機(jī)制：機(jī)制Ⅰ，即主動(dòng)吸鉀過程，指外界鉀濃度小于0.2 mmol?L-1時(shí)起主要作用的高親和性鉀吸收系統(tǒng)；機(jī)制Ⅱ，即被動(dòng)吸鉀過程，指外界鉀濃度大于1 mmol?L-1時(shí)起主要作用的低親和性鉀吸收系統(tǒng)[9-10]。植物體內(nèi)鉀離子的動(dòng)態(tài)平衡及分配主要由定位于細(xì)胞質(zhì)膜的各類鉀離子通道來介導(dǎo)完成，其中，Shaker類鉀通道研究最為透徹，在植物鉀素營養(yǎng)高效中起至關(guān)重要的作用。Shaker類鉀通道對(duì)底物K+的親和常數(shù)約在數(shù)十mmol?L-1，屬于典型的低親和、高通量的鉀離子通道。1992年，Anderson等[11]和Sentenac等[12]分別在模式植物擬南芥中報(bào)道了第一個(gè)植物Shaker類型鉀離子通道KAT1和AKT1，此后20年內(nèi)，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)從不同植物中發(fā)現(xiàn)了30多個(gè)的鉀離子通道[13-15]。另外，擬南芥AthSKOR[4]和AthGORK[16]是兩類外向整流型鉀離子通道，其中，主要在葉片保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，該通道功能缺失后導(dǎo)致氣孔關(guān)閉受抑制，也可以被蛋白激酶CPK33調(diào)節(jié)[15-17]；主要定位于擬南芥根的中柱鞘和中柱薄壁細(xì)胞，負(fù)責(zé)將韌皮部的鉀離子分泌至木質(zhì)部，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)鉀離子經(jīng)由木質(zhì)部的根-莖長距離運(yùn)輸，介導(dǎo)典型的電壓依賴型鉀外排過程，該通道功能缺失后導(dǎo)致地上部含鉀量降低約50%[4]。此后，在水稻[18]、小花堿茅[19]、霸王[20]、甜瓜[14]、黑果枸杞[21]等多種植物中陸續(xù)報(bào)道了SKOR型鉀離子通道，發(fā)現(xiàn)這些鉀通道具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)特征，并包含一段極保守的標(biāo)簽序列GYGD。【本研究切入點(diǎn)】果樹中，有關(guān)Shaker類鉀離子通道的研究未見報(bào)道，的生物學(xué)功能有待研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以‘馬瑟蘭’葡萄為材料，克隆，明確其表達(dá)模式與電生理功能，為研究果樹鉀素營養(yǎng)高效機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和基因材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年1月至2019年11月在魯東大學(xué)農(nóng)林作物遺傳改良中心、國家現(xiàn)代葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系煙臺(tái)綜合試驗(yàn)站和劍橋大學(xué)植物系離子運(yùn)輸研究室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 試驗(yàn)材料與脅迫處理 供試材料為現(xiàn)代技術(shù)綜合的7年生‘馬瑟蘭’葡萄樹，樹形采用單干單臂，直立葉幕，露天籬架栽培，株行距為1 m×2 m，樹體健壯，常規(guī)田間管理。樣品采集參照王壯偉等[22]方法，分別于2019年不同日期采集7年生‘馬瑟蘭’的顯露期花序（4月21號(hào)）、新生葉片（5月10號(hào)）、韌皮部（5月18號(hào)）、盛開期的花（5月18號(hào)，花序中部）、新生根（5月28號(hào)）、幼果（5月28號(hào)）和熟果（9月29號(hào)）等組織材料，液氮充分冷凍后保存于超低溫冰箱。非生物脅迫處理所用材料為國家現(xiàn)代葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系煙臺(tái)綜合試驗(yàn)站提供的‘馬瑟蘭’組培幼苗，根據(jù)王壯偉等[22]方法，在人工氣候箱中利用MS營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)3 d，然后分別進(jìn)行缺鉀（MS配方中的KNO3和KH2PO4分別被NaNO3和NaH2PO3代替）、高鉀（40 mmol·L-1KCl）、脫落酸（200 μmol·L-1ABA）和鹽脅迫（160 mmol·L-1NaCl）等處理，每個(gè)處理進(jìn)行3組生物學(xué)重復(fù)，每組處理9株幼苗，處理48 h后，分別采集幼苗根、莖和葉片等材料，液氮冷凍后備用。

1.2.2 葡萄克隆 以擬南芥AthSKOR（AT3G02850）氨基酸序列為參考，在Phytozome葡萄基因組（http://www.phytozome.net）中檢索得到一個(gè)SKOR同源蛋白，在Pfam在線服務(wù)器（http://pfam. xfam.org/search）預(yù)測(cè)功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)Phytozome獲得的葡萄的CDS序列，分別設(shè)計(jì)上下游引物（表1），利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大連）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 葡萄生物信息學(xué)分析 在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中下載的CDS序列、基因組DNA序列、啟動(dòng)子區(qū)域序列和編碼氨基酸序列。根據(jù)王壯偉等[22]的方法，分別利用Gene Structure Display、PSORT和Plant CARE在線服務(wù)器預(yù)測(cè)的基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和-順式作用元件；運(yùn)用TMpredict和ProtParam在線軟件分析VviSKOR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、理論等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、親水性等理化特征；利用ClustalX 2.0軟件對(duì)葡萄、擬南芥、水稻、玉米、高粱、短柄草、大豆、番茄、黃瓜、白楊、桃、梨、草莓、蘋果、木瓜、柑橘、香蕉、鳳梨等18種不同科屬植物的SKOR同源蛋白進(jìn)行氨基酸序列一致性分析，借助MEGA 7.0軟件對(duì)上述18種植物的SKOR同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜信息分析的表達(dá)模式。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用RNA提取試劑盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）分別提取組培幼苗和7年生葡萄樹不同組織材料的總RNA；借助反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA；通過NCBI/Primer-BLAST在線服務(wù)器設(shè)計(jì)的特異性表達(dá)引物（表1），以葡萄（GenBank No. MH114011）作為內(nèi)參基因，熒光染料使用SYBR Green（TaKaRa，大連），參照王壯偉等[22]的方法在ABI 7500熒光定量PCR儀分析的表達(dá)特征，在ABI 7500 PCR儀獲得相應(yīng)反應(yīng)的Ct值，經(jīng)內(nèi)參基因均一化后，利用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[23]。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 pTracer-CMV3-表達(dá)載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)載體pTracer-CMV3-的特異引物對(duì)，上游引物添加酶切位點(diǎn)I，下游引物添加酶切位點(diǎn)I（表1，下劃線已標(biāo)注），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶R I/I（New England Biolabs，美國）雙酶切作用后，利用T4DNA連接酶（New England Biolabs，美國）構(gòu)建到同樣雙酶切的pTracer-CMV3載體多克隆位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)載體pTracer-CMV3-，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑選陽性克隆，經(jīng)R I/I雙酶切驗(yàn)證后，再次送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.6 膜片鉗電生理研究 按照Su等[24]的方法，通過膜片鉗電生理系統(tǒng)進(jìn)行的功能研究：純化濃縮后的pTracer-CMV3-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293-T細(xì)胞（ATCC公司，美國），同時(shí)轉(zhuǎn)染pTracer-CMV3空載體作為對(duì)照試驗(yàn)，挑取帶綠色熒光的細(xì)胞，利用pCLAMP 10.0（Axon，美國）采集通道基因的電流信號(hào)，借助pCLAMP 10.0和SigmaPlot 10.0軟件進(jìn)行圖像采集及數(shù)據(jù)分析。每種KCl濃度下選擇5個(gè)細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)性研究。

1.2.7 數(shù)據(jù)顯著性分析 利用SPSS 13.0軟件（SPSS Chicago，美國）開展數(shù)據(jù)的顯著性分析，在脅迫處理與對(duì)照條件兩個(gè)獨(dú)立樣品間進(jìn)行-檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水平0.01＜*＜0.05；**＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 葡萄VviSKOR的克隆

以擬南芥AthSKOR氨基酸序列為參考序列，在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中檢索得到1個(gè)同源基因，命名為（Gene ID：GSVIVT01030667001），在Pfam在線服務(wù)器預(yù)測(cè)到環(huán)核苷酸結(jié)合域（PF00027）、離子通道跨膜域（PF00520）、Ankyrin重復(fù)序列（PF12796）和KHA（PF11834）等功能結(jié)構(gòu)域（圖1-A），并檢測(cè)到極保守的標(biāo)簽序列GYGD，表明葡萄VviSKOR屬于典型的外排型鉀離子通道。擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，獲得‘馬瑟蘭’葡萄的的CDS序列，共2 385 bp，編碼794個(gè)氨基酸。

2.2 VviSKOR定位、編碼蛋白特征

由數(shù)據(jù)庫信息可知，定位于第14號(hào)染色體上，含有12個(gè)長度不一的內(nèi)含子（圖1-B）；VviSKOR蛋白含有6個(gè)跨膜區(qū)，等電點(diǎn)PI為6.24，表明其含有的酸性氨基酸較多；VviSKOR蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為39.85，屬于穩(wěn)定蛋白；VviSKOR的GRAVY值為-0.108，表明其為親水性蛋白質(zhì)。

2.3 18種不同植物SKOR同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

不同科屬植物SKOR同源蛋白之間具有較高的同源性，兩兩物種之間同源蛋白的氨基酸序列一致性均高于78%，18種植物SKOR同源成員在氨基酸水平依然具有58.92%的一致性（表2），尤其在第250位至700位的氨基酸序列一致性最為顯著（圖2），在核苷酸水平具有62.03%的一致性（數(shù)據(jù)未展示）。

A：結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；B：基因結(jié)構(gòu)分析 A: Domain prediction; B: Gene structure analysis

表1 本研究所用特異性引物

表2 19種已測(cè)序植物SKOR蛋白信息

系統(tǒng)進(jìn)化樹建構(gòu)結(jié)果表明，18種不同科屬植物SKOR同源蛋白在遺傳進(jìn)化關(guān)系上有較大差異：其中，葡萄和黃瓜同為雙子葉植物，葡萄VviSKOR和黃瓜CsaSKOR在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上緊密聚在一起，在遺傳距離上可能是相近的（圖3）；水稻、玉米、高粱和短柄草同為禾本科植物，其SKOR同源蛋白在進(jìn)化關(guān)系上更傾向于聚在一起，蘋果、梨、桃和草莓同屬薔薇科植物，其SKOR同源蛋白更傾向于聚在一起，在遺傳距離上更為相近，而薔薇科的木瓜卻與擬南芥、番茄和柑橘等不同屬的雙子葉植物在遺傳距離上相近，其SKOR同源蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹上緊密聚在一起（圖3）。

圖2 18種植物SKOR高保守氨基酸序列區(qū)域一致性分析

圖3 18種植物SKOR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 VviSKOR亞細(xì)胞定位及啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

如圖4所示，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明主要定位于細(xì)胞膜（約占33%）和線粒體內(nèi)膜（29%），其次是高爾基體（22%）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（22%）。

-順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到至少12種順式作用元件（表3），包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域、脅迫響應(yīng)（低溫感應(yīng)、光感應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)等）、激素響應(yīng)（茉莉酮酸甲酯MeJ-A、脫落酸ABA等）、細(xì)胞周期調(diào)控等不同生命活動(dòng)相關(guān)的調(diào)控元件（表3）。

圖4 VviSKOR亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

表3 VviSKOR啟動(dòng)子順式作用元件分析

2.5 VviSKOR表達(dá)分析

Phytozome數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜分析表明，在根部的表達(dá)水平最高（約占65%），其次是葉（13%），此外，在木質(zhì)部（6%）、果實(shí)（5%）、果皮（4%），雌蕊（4%）、花瓣（3%）和花粉（1%）中也有表達(dá)（圖5）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，在7年生‘馬瑟蘭’葡萄樹不同組織、器官中的表達(dá)水平有差異：在根部的表達(dá)水平最高，其次是一年生韌皮部和新葉，在花序、花和果實(shí)（幼果、熟果）中的表達(dá)水平較低（圖6）。

2.6 幼苗中VviSKOR對(duì)脅迫處理的響應(yīng)

以‘馬瑟蘭’幼苗為材料，設(shè)置不同非生物脅迫處理，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。結(jié)果表明，主要在幼苗根部表達(dá)，在葉片和莖部表達(dá)量較低，再次證實(shí)該基因主要定位于葡萄根部并發(fā)揮作用。此外，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)不同脅迫處理的響應(yīng)有差異，對(duì)缺鉀、ABA和NaCl處理最為敏感，而對(duì)高鉀脅迫沒有響應(yīng)，其中，缺鉀和ABA處理分別顯著抑制在幼苗根部、莖部和葉片中的表達(dá)水平，而NaCl處理則顯著誘導(dǎo)在所有檢測(cè)組織中的表達(dá)水平（圖7）。

2.7 VviSKOR的電生理功能

以轉(zhuǎn)染pTracer-CMV3空載體的HEK293-T細(xì)胞作為空白對(duì)照，通過pCLAMP 10.0膜片鉗系統(tǒng)記錄pTracer-CMV3-在外界不同K+濃度條件下電流特征曲線。結(jié)果表明，表達(dá)pTracer-CMV3-的細(xì)胞記錄到大量的外向整流電流，且外向電流隨細(xì)胞外鉀離子濃度的增加而降低，初步證實(shí)VviSKOR是一個(gè)典型的外流型鉀離子通道（圖8）；此外，記錄到的電流隨著電壓的增加而增加，說明VviSKOR也是電壓依賴型鉀離子通道。

圖5 VviSKOR表達(dá)譜分析

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析VviSKOR在7年生葡萄樹不同組織的表達(dá)特征

3 討論

鉀素營養(yǎng)與果樹的生長發(fā)育、果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量密切相關(guān)[1-3,25]。然而，大量報(bào)道主要體現(xiàn)在生理生化層面，果樹鉀素營養(yǎng)高效的分子機(jī)制研究很少。植物SKOR蛋白是一類外向整流型的Shaker類鉀離子通道[4,8]，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用。21世紀(jì)以來，基因組測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展，為植物科學(xué)研究提供了便利。本研究生物信息學(xué)分析表明，葡萄VviSKOR蛋白含有相同的植物Shaker類鉀離子通道的功能結(jié)構(gòu)域，包括6個(gè)跨膜區(qū)和GYGD通道標(biāo)簽序列，且多重序列比對(duì)顯示，這些結(jié)構(gòu)相似的通道屬于同一家族，在其核心區(qū)域具有高度的序列一致性[2-3]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明不同物種SKOR通道成員在遺傳進(jìn)化關(guān)系上存在差異，禾本科植物（水稻、玉米、高粱和短柄草）SKOR同源蛋白一致性更高，在進(jìn)化關(guān)系上更為緊密，相似地，薔薇科植物（蘋果、梨、桃和草莓）SKOR同源蛋白在遺傳距離上更為相近。葡萄VviSKOR和黃瓜CsaSKOR在所檢測(cè)植物的同源蛋白中緊密聚在一起，推測(cè)其生理功能可能具有相似性。

**表示差異極顯著（P＜0.01）

圖8 利用膜片鉗技術(shù)研究VviSKOR電生理功能

前人研究表明擬南芥和等Shaker類離子通道基因主要定位于細(xì)胞膜上[2-4]，本研究亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)也揭示葡萄主要定位在細(xì)胞膜和線粒體內(nèi)膜上，仍需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜表明基因主要在葡萄根部表達(dá)，與前人報(bào)道基本吻合[4,14,16-21]；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與表達(dá)譜分析結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證在‘馬瑟蘭’成年樹根部或幼苗根部的表達(dá)量均最高，推測(cè)該通道基因主要在葡萄根部鉀素營養(yǎng)動(dòng)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

植物SKOR通道在K+動(dòng)態(tài)平衡、滲透調(diào)節(jié)和質(zhì)子調(diào)控中起重要作用，且在轉(zhuǎn)錄水平易受外界K+供應(yīng)水平和干旱、ABA、NaCl等非生物脅迫的調(diào)控[14,16-21]。熒光定量PCR結(jié)果表明葡萄幼苗中缺鉀顯著下調(diào)的表達(dá)，與擬南芥[3]、甜瓜[14]、霸王[20]的報(bào)道一致，推測(cè)缺鉀條件下表達(dá)量的下降，可能反映了植物本身缺鉀時(shí)，沒有過多的鉀往地上部運(yùn)輸，所以減少了SKOR的需求量（表達(dá)豐度）；作為一種抑制生長的植物激素，ABA顯著抑制在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，與此同時(shí)，在啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到ABA激素響應(yīng)的順式作用元件，暗示SKOR鉀通道的活性易受ABA調(diào)控，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究；相反地，NaCl顯著上調(diào)的表達(dá)，與黃瓜[14]、霸王[20]和黑果枸杞[21]中的報(bào)道一致，充分證實(shí)SKOR鉀通道的活性易受NaCl調(diào)控，且參與調(diào)控Na+/K+離子平衡和滲透勢(shì)，具體機(jī)制亟待深入解析。此外，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)高鉀脅迫沒有響應(yīng)，暗示葡萄樹體中的豐度夠多，足以維持其在高鉀環(huán)境中正常發(fā)揮作用。

在生理功能水平上，植物SKOR蛋白是典型的外向整流型鉀離子通道，屬于鉀離子選擇性的Shaker類家族通道，在模式作物擬南芥和甜瓜中均已利用非洲爪蛙卵和雙電極電壓鉗技術(shù)證明[3,14]。本研究利用膜片鉗技術(shù)證實(shí)表達(dá)的HEK293-T細(xì)胞展現(xiàn)出外向整流型通道的特點(diǎn)：K+外排型電流，且通道活性（外向電流激活閾值）依賴于K+濃度，與擬南芥和甜瓜中K+電流特征的報(bào)道類似[3,14]，但其在葡萄中運(yùn)輸K+的特點(diǎn)和具體調(diào)控機(jī)理還未清晰，與其他模式作物同源基因的功能差異尚無法進(jìn)行比較。綜上可知，VviSKOR是葡萄根中一個(gè)具有K+通透性的Shaker類外向整流型鉀通道，K+可以調(diào)節(jié)VviSKOR的功能。

4 結(jié)論

從葡萄中鑒定并克隆了鉀離子通道基因；葡萄VviSKOR與黃瓜CsaSKOR成員在遺傳距離上較近；主要在葡萄根部表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄水平受缺鉀、ABA和NaCl脅迫的調(diào)控；膜片鉗研究表明VviSKOR是葡萄中一個(gè)電壓門控的外排型鉀離子通道。研究結(jié)果為解析果樹內(nèi)部離子動(dòng)態(tài)平衡和鉀素營養(yǎng)高效機(jī)制奠定了技術(shù)支撐，并為園藝作物的遺傳改良與分子育種提供了基因資源和理論指導(dǎo)。

[1] VéRY A A, SENTENAC H. Molecular mechanisms and regulation of K+transport in higher plants., 2003, 54(1): 575-603.

[2] VéRY A A, NIEVES-CORDONES M, DALY M, KHAN I, FIZAMES C, SENTENAC H. Molecular biology of K+transport across the plant cell membrane: What do we learn from comparison between plant species?, 2014, 171(9): 748-769.

[3] GRABOV A. Plant KT/KUP/HAK potassium transporters: Single family-multiple functions., 2007, 99(6): 1035-1041.

[4] GAYMARD F, PILOT G, LACOMBE B, BOUCHEZ D, BRUNEAU D, BOUCHEREZ J, MICHAUX-FERRIèRE N, THIBAUD J B, SENTENAC H. Identification and disruption of a plant shaker-like outward channel involved in K+release into the xylem sap., 1998, 94(5): 647-655.

[5] GIERTH M, M?SER P. Potassium transporters in plants-involvement in K+acquisition, redistribution and homeostasis., 2007, 581(12): 2348-2356.

[6] LEBAUDY A, VéRY A A, SENTENAC H. K+channel activity in plants: Genes, regulations and functions.2007, 581(12): 2357-2366.

[7] WARD J M, M?SER P, SCHROEDER J I. Plant ion channels: Gene families, physiology, and functional genomics analyses., 2009, 71: 59-82.

[8] WANG Y, WU W H. Regulation of potassium transport and signaling in plants., 2017, 39: 123-128.

[9] KOCHIAN L V, LUCAS W J. Potassium transport in corn roots: Resolution of kinetics into a saturable and linear component., 1982, 70(6): 1723-1731.

[10] EPSTEIN E, RAINS D W, ELZAM O E. Resolution of dual mechanisms of potassium absorption by barley roots., 1963, 49(5): 684-692.

[11] ANDERSON J A, HUPRIKAR S S, KOCHIAN L V, LUCAS W J, GABER R F. Functional expression of a probablepotassium channel in., 1992, 89(9): 3736-3740.

[12] SENTENAC H, BONNEAUD N, MINET M, LACROUTE F, SALMON J M, GAYMARD F, GRIGNON C. Cloning and expression in yeast of a plant potassium ion transport system., 1992, 256(5057): 663-665.

[13] WANG Y, WU W H. Potassium transport and signaling in higher plants., 2013, 64(1): 451-476.

[14] HUANG L T, ZHAO L N, GAO L W. Constitutive expression of, an outward K+channel gene from melon, ininvolved in saline tolerance., 2018, 274: 492-502.

[15] CORRATGé-FAILLIE C, RONZIER E, SANCHEZ F, PRADO K, KIM J H, LANCIANO S, LEONHARDT N, LACOMBE B, XIONG T C. Theguard cell outward potassium channel GORK is regulated by CPK33., 2017, 591(13): 1982-1992.

[16] ACHE P, BECKER D, IVASHIKINA N, DIETRICH P, ROELFSEMA M R G, HEDRICH R. GORK, a delayed outward rectifier expressed in guard cells of, is a K+-selective, K+-sensing ion channel., 2000, 486(2): 93-98.

[17] HOSY E, VAVASSEUR A, MOULINE K, DREYER I, GAYMARD F, PORéE F, BOUCHEREZ J, LEBAUDY A, BOUCHEZ D, VERY A A, SIMONNEAU T, THIBAUD J B, SENTENAC H. Theoutward K+channel GORK is involved in regulation of stomatal movements and plant transpiration., 2003, 100(9): 5549-5554.

[18] KIM H Y, CHOI E H, MIN M K, HWANG H, MOON S J, YOON I, BYUN M O, KIM B G. Differential gene expression of two outward-rectifying shaker-like potassium channels OsSKOR and OsGORK in rice., 2015, 58: 230-235.

[19] 段麗婕, 王沛, 陳夢(mèng)詞, 王鎖民. 鹽生植物小花堿茅外整流K+通道基因的克隆及RNAi載體構(gòu)建. 分子植物育種, 2015, 13(4): 877-886.

DUAN L J, WANG P, CHEN M C, WANG S M. Cloning outward-rectifying potassium channelgene and constructing its RNAi vector in Halophyte., 2015, 13(4): 877-886. (in Chinese)

[20] HU J, MA Q, KUMAR T, DUAN H R, ZHANG J L, YUAN H J, WANG Q, KHAN S A, WANG P, WANG S M. ZxSKOR is important for salinity and drought tolerance ofby maintaining K+homeostasis., 2016, 80(2): 195-205

[21] 劉麗萍, 戴逢斌, 張沖, 田菊, 陳金煥. 黑果枸杞外整流鉀離子通道基因的克隆及表達(dá)分析. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 35(1): 104-111.

LIU L P, DAI F B, ZHANG C, TIAN J, CHEN J H. Cloning and expression analysis of thegene for an outward rectifying K+channel in., 2018, 35(1): 104-111. (in Chinese)

[22] 王壯偉, 王慶蓮, 夏瑾, 王西成, 宋志忠, 吳偉民. 葡萄KEA 家族基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51(23): 4522-4534.

WANG Z W, WANG Q L, XIA J, WANG X C, SONG Z Z, WU W M. Cloning, characterization and expression analysis of K+/H+antiporter genes in grape., 2018, 51(23): 4522-4534. (in Chinese)

[23] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod., 2001, 25(4): 402-408.

[24] SU Y H, NORTH H, GRIGNON C, THIBAUD J B, SENTENAC H, VéRY A A. Regulation by external K+in a maize inward shaker channel targets transport activity in the high concentration range., 2005, 17(5): 1532-1548.

[25] 宋志忠, 郭紹雷, 馬瑞娟, 俞明亮. KT/HAK/KUP家族基因在桃開花期的表達(dá)及對(duì)鉀肥施放的響應(yīng)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(6): 1177-1185.

SONG Z Z, GUO S L, MA R J, YU M L. Analysis of expression of KT/HAK/KUP family genes and their responses to potassium fertilizer application during peach flowering., 2015, 48(6): 1177-1185. (in Chinese)

Cloning, Expression and Electrophysiological Function Analysis of Potassium Channel Genein Grape

SHEN JingYuan1, TANG MeiLing2, YANG QingShan1, 3, GAO YaChao1, LIU WanHao1, 2, CHENG JieShan1, ZHANG HongXia1, SONG ZhiZhong1, 4

(1College of Agriculture, Ludong University/Key Laboratory of Molecular Module-Based Breeding of High Yield and Abiotic Resistant Plants in Universities of Shandong, Yantai 264025, Shandong, China;2Institute of Grape, Yantai Academy of Agricultural Science, Yantai 264000, Shandong, China;3Shandong Academy of Forestry, Jinan 250014, China;4Department of Plant Science, University of Cambridge, Cambridge UK CB2 3EA)

【】The aim of this study was to isolate and characterize potassium (K+) channel gene(stelar K+outward rectifier) from grape genome, based on the analysis of the tissue-specific expression patterns ofgene and response to K+depletion, K+excess, NaCl and ABA treatments, as well as function study by patch clamping electrophysiological technology.【】By carrying out homology-based cloning, a putative K+channel genewas screened and isolated from grape genome. The details ofgene were analyzed, and the protein encoded via utilizing bioinformatical analysis software.With the help of MEGA7.0 software, a phylogenetic tree was constructed by multiple alignments of SKOR proteins from grape,, rice, maize, sorghum, slender false brome, soybean, tomato, cucumber, poplar, peach, pear, strawberry, apple, papaya, citrus, banana and pineapple. Using quantitative real-time PCR (qRT-PCR), the expression profiles ofgene and its response to K+depletion, NaCl and ABA treatments were analyzed. Preliminary analized the physiological function ofgene by using patch clamping.【】was isolated and determined from grape genome. VviSKOR contained the functional domains of cyclic nucleotide-binding domain, ion channel transmembrane, ankyrin repeats and KHA domain, which belonged to the classic plant potassium channels. The amino acid sequences of SKOR protein from 18 plants shared an overall identity of 58.92%. Phylogenetic tree analysis showed that VviSKOR was closely clustered with homolog of CsaSKOR from cucumber. SKOR members from 4 grass family plants (maize, rice, slender false brome and sorghum) were prone to be clustered together, while SKOR members from, including strawberry, apple, pear and peach, were prone to be clustered together. VviSKOR was mainly localized in plasma membrane, which contained 6 transmembrane domains (TMs), and the theoretical isoelectric point (I) was 6.24. Twelve kinds of-acting regulatory elements, including stress response, hormone response and cell cycle regulation, were found in the promoter region ofgene. Database expression profile analysis showed thatgene was expressed in different tissues or organs in grape, and the highest percentage was predicted in roots, followed by leaves and xylem. qRT-PCR analysis showed thatgene was mainly expressed in roots of both 7-year-old ‘’ and young seedlings. Moreover,gene was more sensitive to K+depletion, ABA and NaCl treatments, whose expression were decreased under K+depletion and ABA treatments, but induced under NaCl treatment in all tested tissues, including roots, and roots. Expression ofgene had no response to NaCl treatment. Preliminary evidence of patch clamp analysis revealed that outward current was recorded in HEK293-T cells transfected with pTracer-CMV3-plasmid, and the amount of released K+was reduced with elevated external-K+, indicating that VviSKOR was an outwardly rectifying K+channel. In addition, the recorded current increased with the enhancement of voltage, indicating that VviSKOR was also a voltage dependent K+channel.【】genewas mainly expressed in grape roots (mature trees and seedlings). VviSKOR was closely clustered with homolog of CsaSKOR from cucumber in phylogenetic tree. Expression ofgene was prone to be regulated by K+depletion, ABA, and NaCl treatment.VviSKORwas an outwardly rectifying K+channel that dominated the K+release in grape roots.

grape; Shaker type potassium channel; SKOR; gene cloning and expression; patch clamping

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.015

2019-12-30；

2020-02-23

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD1000500）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程基金（2019LZGC009-2）、山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018JH2006）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-29-16）

沈靜沅，Tel：0535-6664662；E-mail：1391570440@qq.com。唐美玲，Tel：0535-6352051；E-mail：tmling1999@163.com。沈靜沅與唐美玲為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者宋志忠，Tel：0535-6664662；E-mail：szhzh2000@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）