Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化夏枯草中科羅索酸和山楂酸提取工藝

黃寬，向潤(rùn)清，張艷嬌，付鵬，李江，范源，2

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，有清肝火、明目、消腫、散結(jié)等功效[1]。夏枯草主要化學(xué)成分為三萜類(lèi)、甾醇類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、有機(jī)酸和糖類(lèi)等成分[2]，而以熊果酸為主的三萜類(lèi)化合物是重要的活性成分，熊果酸的衍生物科羅索酸和山楂酸是一對(duì)五環(huán)三萜類(lèi)同分異構(gòu)體化合物（見(jiàn)圖1），屬烏蘇烷型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有調(diào)節(jié)免疫[3]、抗氧化[4-6]、抗炎[7-8]、抗菌[9]、抗過(guò)敏[10]、抗腫瘤[11]和降低膽固醇[12]作用，基本骨架為多氫蒎的五環(huán)母核，多采用HPLC 進(jìn)行定量分析[13-17]?？屏_索酸和山楂酸為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似，出峰時(shí)間接近，分離測(cè)定存在一定難度。目前夏枯草中科羅索酸和山楂酸提取工藝相關(guān)報(bào)道較少。本研究建立夏枯草中科羅索酸和山楂酸HPLLC 定量分析方法，優(yōu)化其提取工藝，為夏枯草的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

取同一批樣品6 份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果科羅索酸、山楂酸含量RSD 分別為1.57%、0.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的同一批樣品（每1 g 夏枯草中含科羅索酸0.487 5 mg、山楂酸0.275 0 mg）粉末6份，每份精密稱(chēng)取1 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，加入科羅索酸和山楂酸對(duì)照品適量（約相當(dāng)于1.0 g 樣品中所含科羅索酸和山楂酸的量），再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 夏枯草中科羅索酸和山楂酸加樣回收率試驗(yàn)

2.2 單因素試驗(yàn)

采用加熱回流法提取夏枯草中的科羅索酸和山楂酸，將料液比、加熱回流時(shí)間、回流次數(shù)及乙醇濃度作為影響因素，固定其中3 個(gè)因素，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)另一因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。固定提取時(shí)間為60 min、提取次數(shù)為1 次、料液比為1∶10 g/mL，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（75%、80%、85%、90%）對(duì)提取率的影響，優(yōu)選最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。按優(yōu)選條件依次考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL）、提取時(shí)間（60、80、100、120 min）、提取次數(shù)（1、2、3 次）對(duì)提取效果的影響。結(jié)果最佳條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20（g/mL），提取時(shí)間120 min，提取次數(shù)2 次。見(jiàn)圖2。

圖2 夏枯草中科羅索酸和山楂酸提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

依據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行因素水平設(shè)計(jì)與試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 夏枯草中科羅索酸和山楂酸提取工藝因素水平表

2.3.2 模型擬合與方差分析采用Design-expert8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得回歸方程Y＝815.38＋6.72A＋5.17B＋13.33C＋7.78D－0.65AB＋5.65AC－1.27AD＋1.25BC－4.75BD－2.82CD－5.44A2－18.23B2－41.52C2－15.23D2，R2＝0.960 5。F＝24.30，P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)F＝0.53，P＝0.808 2，表明模型失擬項(xiàng)不顯著，可用于分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。以Y 為響應(yīng)值時(shí)，模型的一次項(xiàng)影響順序?yàn)镃＞D＞A＞B，一次項(xiàng)C 和二次項(xiàng)B2、C2、D2有極顯著影響（P＜0.001），一次項(xiàng)A、D 有高度顯著影響（P＜0.01），一次項(xiàng)B 有顯著影響（P＜0.05），表明所得回歸方程能較好地預(yù)測(cè)各影響因素對(duì)提取效果的影響。見(jiàn)表4。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化及預(yù)測(cè)

經(jīng)Design-expert8.0.6 軟件分析得到響應(yīng)面圖（見(jiàn)圖3）?？梢钥闯?，提取次數(shù)對(duì)總含量影響較大，交互項(xiàng)對(duì)總含量無(wú)顯著影響，忽略交互作用，以回歸模型的極值分析得到最優(yōu)提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)88.47%，提取時(shí)間102.22 min，提取次數(shù)2.20 次，料液比1∶20.95（g/mL），科羅索酸和山楂酸總含量預(yù)測(cè)值為820.09 μg。綜合實(shí)際情況考慮，調(diào)整最優(yōu)提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)88.5%，提取時(shí)間100 min，提取次數(shù)2 次，料液比1∶20（g/mL）。

本研究預(yù)試驗(yàn)分別對(duì)不同提取溶劑（甲醇、乙醇）和不同提取方式（超聲提取、加熱回流提取、浸漬提?。┻M(jìn)行了考察，結(jié)果表明，乙醇加熱回流提取對(duì)科羅索酸和山楂酸的提取效果最好。此條件下所得目標(biāo)產(chǎn)物含量最高，色譜峰雜峰少，操作簡(jiǎn)便。同時(shí)以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果表明甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)色譜圖峰形好，分離效果好且基線平穩(wěn)。對(duì)提取液中科羅索酸和山楂酸的含量測(cè)定進(jìn)行方法學(xué)考察結(jié)果表明，其專(zhuān)屬性、線性關(guān)系、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)均符合分析要求，儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、精確度RSD 均小于2.0%。

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到科羅索酸和山楂酸加熱回流提取的最佳工藝:乙醇體積分?jǐn)?shù)88%，料液比1∶20，提取時(shí)間100 min，提取2 次。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取工藝所得科羅索酸和山楂酸總含量為817.8 μg，擬合模型能較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)提取效果，說(shuō)明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝合理可行。