月腺大戟素A 干預CXCR4 表達對間充質干細胞向心肌梗死區遷移的影響

趙玥，王瑩，趙亮，李蘭英，王奕，牌銘欣，張貴振，王強利

1.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203；2.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203；3.上海寶山區羅店醫院，上海 201908；4.同濟大學附屬第四人民醫院，上海 200081

目前，干細胞治療是修復梗死心肌組織、抑制心室重構、增強心功能的有效手段。然而，極低的留存率嚴重限制了干細胞修復心肌組織的潛能[1]。CXC 趨化因子受體 4（CXCR4）是基質細胞衍生因子-1（SDF-1）重要受體之一，在心肌梗死后機體干細胞的動員和向受損心肌組織遷移中發揮關鍵作用[2]。上調CXCR4 表達水平能明顯增強干細胞的遷移能力，并促使其在心肌梗死區定居，進而增加心室壁厚度和新生血管密度，提高心功能[3-5]。因此，促進干細胞表達CXCR4 是促進移植干細胞向心肌梗死區遷移，增強干細胞治療心肌梗死作用的有效途徑。有研究顯示，中藥制劑或中藥有效成分能通過促進干細胞表達CXCR4，增強其治療作用[6-7]。基于前期研究構建了293-CXCR4 細胞株并篩選出能增強CXCR4 啟動子活性的月腺大戟素A（ebracteolatain A，EA），本研究進一步探索EA 促進間充質干細胞（MSCs）CXCR4表達的作用，并驗證其在促進MSCs 遷移和向梗死心肌區歸巢中的作用。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠，雌性12 只，雄性1 只，體質量（200±20）g，上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SYXK（滬）2014-0008。飼養于上海中醫藥大學SPF 級實驗動物中心，自由攝食飲水。

1.2 藥物及細胞系

EA（純度＞98%）購于上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號ST206201-7110。293-CXCR4 細胞系為本實驗室建立[8]。

1.3 主要試劑與儀器

雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，Promega 公司；CCK-8 試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；細胞培養所需的DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）、100×青-鏈霉素和0.25%胰酶（含0.02%EDTA），Bioind 公司；細胞培養瓶、培養板和8.0 μmol/L Transwell 小室，Corning 公司；兔抗大鼠多克隆抗體CXCR4，Novus公司；基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase2，MMP2）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），Cell Signaling Technology 公司；磷酸化Akt、GAPDH，Proteintech 公司；小鼠單克隆抗體Akt，SBI公司；HRP 標記的山羊抗兔、抗小鼠二抗，Proteintech公司；Alexa Fluor?488 AffiniPure 山羊抗兔熒光二抗，Jackson 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），Sigma公 司； Lipofectamine MAX 和 Opti-MEM ，ThermoFisher 公司。酶標儀（Synergy 2，BioTek 公司），全自動化學發光成像分析系統（Tanon 5200，上海天能），倒置熒光顯微鏡（IX51，Olympus）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

37 ℃恒溫水浴復蘇293-CXCR4 細胞，用含10%FBS 的DMEM 培養基培養于37 ℃、5%CO2培養箱，每3 d 傳代1 次。

2.2 雙熒光素酶報告基因檢測

將293-CXCR4 細胞以1×105/mL 的密度鋪于96孔板，待細胞匯合度約90%～95%后更換為無血清培養基，設為4 組，分別加入終濃度為0、5、10、20 μmol/L EA，每組6 個平行孔。孵育24 h 后，用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性值。

2.3 間充質干細胞分離培養

應用差速貼壁法分離雄性大鼠骨髓中MSCs。脫頸處死大鼠，浸泡于75%乙醇中消毒8 min，取出雙側股骨和脛骨。剔除骨組織周圍組織后，暴露骨髓腔，用注射器抽取10 mL PBS 沖洗骨髓腔，收集于15 mL離心管中，1000 r/min 離心10 min，棄上清液，用含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養液重懸細胞，以5×105個/mL 的細胞密度均勻接種于25 cm2培養瓶中，在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。第3 日更換培養液后繼續培養，當細胞匯合70%～80%時傳代，取3～5 代MSCs 進行后續實驗。

2.4 細胞毒性檢測

將MSCs 以1×105/mL 的密度接種于96 孔板，24 h 后各孔分別加入0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 μmol/L EA，每個濃度設6 個平行孔。孵育72 h 后按照說明書用CCK-8 試劑盒檢測各孔細胞活力。使用Graphpad Prism 5.0 處理數據并計算IC50。

5 討論

EA 是從中藥狼毒中分離提取的一種乙酰間苯三酚類化合物，具有抑制腫瘤細胞增殖的作用[10-11]。目前EA 對干細胞生物學特性的影響尚未見報道。在前期研究中，我們構建了293-CXCR4 細胞株，通過雙熒光素酶報告基因檢測技術篩選出能夠激活CXCR4啟動子的中藥單體EA[8]。本研究進一步明確EA 增強CXCR4 啟動子活性的量效關系。同時我們發現低濃度（0～20 μmol/L）EA 對MSCs 無明顯細胞毒性。在此基礎上，應用Transwell 實驗，發現EA 具有增強MSCs 向SDF-1 遷移的作用，且與EA 濃度呈正相關。應用大鼠心肌梗死模型，體內實驗進一步證實EA 具有促進MSCs 向心肌梗死區遷移的作用。

CXCR4 是EA 促進MSCs 遷移的關鍵蛋白。應用Western blot 技術，我們發現EA 能上調MSCs 的CXCR4 蛋白表達，且與EA 濃度呈正相關。因此，CXCR4 可能是參與EA 促進MSCs 向SDF-1 遷移的關鍵蛋白。為證明這一假設，我們使用siRNA 敲低MSCs 的CXCR4 表達，結果顯示EA 促進MSCs 遷移的能力明顯減弱。因此認為，CXCR4 是EA 促進MSCs遷移的關鍵蛋白。

Akt 和MMP2 是SDF-1/CXCR4 信號通路下游重要的信號分子，在細胞遷移中發揮重要作用[12-13]。為進一步探索EA 促進MSCs 遷移的分子機制，我們應用Western blot 技術檢測EA 對MSCs Akt 活性和MMP2 表達的影響，結果顯示EA 能增強MSCs 的Akt 活性，并促進MMP2 表達。

綜上，本研究首次揭示EA 通過上調CXCR4 表達促進MSCs 遷移的作用和分子機制，能為干細胞治療心肌梗死提供先導化合物。