蛹蟲草液體深層發酵過程代謝物的變化

吳敬燚

摘 要：將蛹蟲草置于28℃下230rp/min搖床培養，發酵液用等體積的乙酸乙酯進行萃取，獲得其粗提物，采用薄層層析法（TLC）對提取物進行初步的分離鑒定。

關鍵詞：液體深層發酵;代謝產物

蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）又名北冬蟲夏草，子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科、蟲草屬，是寄生在鱗翅目和鞘翅目等昆蟲蛹體上的真菌。蛹蟲草的藥用與保健價值和冬蟲夏草相似，為我國特有的一類珍貴藥用真菌，其主要成分蟲草素等含量遠高于野生冬蟲夏草，而且比冬蟲夏草更易人工栽培，因此被選為冬蟲夏草的最佳替代品而進行大量的人工培育。其生長受到溫度、光照、培養基條件的影響。對蛹蟲草菌絲生長的環境因子進行研究，結果表明其適宜條件為生長溫度為1～30℃，最適溫度為20℃，茵絲生長的pH范圍是4.5～11.0，最適pH為7.0，菌絲生長階段不需要光照。

蛹蟲草子實體的化學成分含有：麥角甾-4，6，8（14）一四烯-3一酮，檸檬甾二烯醇，二十四烷酸單甘油酯，麥角甾醇（4），麥角甾醇過氧化物，麥角甾-7，22一二烯-33，5，一三醇，蟲草素，腺苷，N一（2-羥乙基）腺苷。

對蛹蟲草次生代謝產物的變化規律報道還較少，其作為冬蟲夏草的替代品，研究并發現其次生代謝產物的變化規律，有利于指導工業化的大生產，以滿足市場的需求。

1 器材和方法

1.1 實驗器材

1.1.1 材料

蛹蟲草

1.1.2 儀器與設備

旋轉蒸發器、冷卻水循環裝置、循環水式多用真空泵、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、生化培養箱、水浴鍋、電子天平、高效薄層硅膠板

1.1.3 試劑

乙酸乙酯、無水硫酸鈉、蛋白胨、無水葡萄糖、展層劑、碘試劑、15%硫酸乙醇溶液。

1.1.4 常用培養基

固體平板活化培養基：馬鈴薯200g/L.（去皮，切成小塊煮沸20min，6層紗布過濾），葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，以水定容。

液體搖瓶培養基：馬鈴薯200g/L.（去皮，切成小塊煮沸20min，6層紗布過濾），葡萄糖20g/L，+1%蛋白胨

1.2 實驗方法

1.2.1 蛹蟲草菌種活化

1）配制PDA培養基100ml;

2）置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，121℃、30min;

3）每平板倒20ml培養基，倒5個培養基;

4）超凈工作臺接入蛹蟲草菌種;

5）平板置于生化培養箱中28℃活化，培養5-6天。

1.2.2 PDA液體培養基的配制

1）配制7.5LPDA培養基，加入1%蛋白胨，充分溶解后分裝于50個250ml三角瓶中，液體培養時裝液量為150ml/250ml;

2）置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、30min滅菌;

1.2.3 接種、培養

1）為保證每瓶接入的菌種數量相等，于超凈工作臺上用已滅菌的膠頭滴管鈍端打孔;

2）用接種針往每瓶培養基接入一塊菌種;

3）將已接如菌種的培養基放入搖床中培養，28℃，230rpm。

1.2.4 過濾、萃取

1）取空白對照，即接入菌種的當天做空白對照，之后每兩天取三瓶培養基，用三層紗布將其分別過濾，并將菌體放入稱量紙中放入烘箱中烘干;

2）發酵液裝進經清洗烘干的棕色試劑瓶中用等量乙酸乙酯混合萃，靜置2天，充分萃取。

1.2.5 旋轉蒸發

1）經分液漏斗分液之后有機相用無水硫酸鈉吸去殘留的水相，過濾。

2）蒸干乙酸乙酯，稱重。

1.2.6 層析

1）將萃取得到的物質用甲醇溶解，濃度為5mg/ml;

2）用毛細管吸取樣品點到已活化的GF254高效薄層層析硅膠板上，點的直徑在2～3mm，距薄層一端距離為1cm左右，各樣品之間的距離一般也控制在1cm左右;

3）將薄層層析硅膠板放入已配制好的展層劑中，當展層劑上行到距離硅膠板另一端1cm處時，取出硅膠板，待溶劑揮發干后于紫外燈下觀察結果;

4）將點過樣品薄層板放入碘缸，進行碘染色;

5）顯色：將點過樣品的薄層板用鑷子直接浸入 15%硫酸乙醇溶液中，取出吹干后放置電爐上小火慢慢烘烤到呈明顯的斑點即可;

6）拍照并比較、分析。

2 結果與分析

2.1 結果

在28℃，230rpm搖床培養下，蛹蟲草代謝產物的情況如下表1。

將上表按平均值與時間之間的關系制成曲線圖：

次生代謝產物經薄層層析，顯色后，圖形如下：

從上圖可以看出蛹蟲草生長過程的代謝物經過薄層層析后在硅膠板上呈現出數量不同的條帶，表明在其生長過程中其次生代謝產物的種類發生了變化。隨著發酵天數的增加，其次生代謝產物種類呈現有規律的變化，且其重量也發生著變化，發酵到第十二天時其代謝產物種類最多，在硅膠板上呈現最多的條帶;之后其在硅膠板上呈現的條帶變化不明顯，表明其代謝產物基本不發生變化。

2.2 分析

蛹蟲草在其開始生長階段1-2天中，其初生代謝產物不斷增加，因其在適應期中細胞數沒有增加，但細胞內的合成代謝十分活躍，表現為代謝產物總量不斷增加;接著細胞利用其數量較多的初生代謝產物合成次生代謝產物，表現為代謝產物的總量下降，而代謝產物的種類上升;當菌體生長到一定階段，其代謝產物的種類達到最多（第12天）;隨后菌體產生一些新的代謝產物，而其總量卻下降了。

在蛹蟲草不斷生長的過程中其生長的環境不斷發生變化，由于培養基的內營養物質濃度的下降、通氣量的不足等原因使得蛹蟲草代謝產物的合成與分泌受到影響。

本實驗探究了蛹蟲草生長過程其代謝產物的變化規律，但其分泌的具體物質及其含量還需進一步研究。

參考文獻

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