基于網絡藥理學和分子對接探討血必凈注射液治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的作用機制

鄭 雅,劉志強,朱曉芹,王博龍*

(1.宜春學院化學與生物工程學院,江西 宜春 336000； 2.鶴壁職業技術學院,河南 鶴壁 458030)

自2019 年12 月以來,出現多起由于感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)而引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例[1-2]。 SARS-CoV-2 具有傳播迅速、傳染性強、各類人群普遍易感的特征。 截止2020 年6 月9 日13 時09 分,我國累計確診患者84636 例,死亡病例4645 例；境外累計確診患者7116552 例,死亡病例404157 例。 特別是近期美國、巴西、俄羅斯、西班牙、英國、意大利、法國等多個國家的激增態勢,COVID-19 的防控現已成為全球挑戰,尋找COVID-19 防治藥物迫在眉睫。

由于SARS-CoV-2 是一種先前未在人類發現的β 屬新型冠狀病毒,目前沒有特效治療藥物[3]。 我國專家及時分析評價前期治療措施,不斷更新COVID-19 的診療方案,為后續治療提供指導。 《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》(試行第五版)于2020 年2 月4 日,由國家衛生健康委及中醫藥管理局發布,并首次增加了血必凈注射液等解毒類中成藥[4],這說明血必凈注射液治療COVID-19 確有療效,但其治療機理并不清楚。 本研究基于網絡藥理學方法,聯合數挖掘、分子對接等技術手段解析血必凈治療COVID-19 的作用機制。

1 材料和方法

1.1 血必凈主要成分及靶點篩選

本研究基于文獻挖掘確定血必凈注射液主要成分,借助TCMSP(http:/ /lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 數據庫收集主要成分靶點, 利用ChemicaoBook 數據庫(https:/ /www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx)查找主要成分分子結構式,保存 mol 格式文件后導入 Swiss Target Prediction(http:/ /www.swisstargetprediction.ch)數據庫,利用相似性靶點搜尋方法查找靶點。 運用UniProt 數據庫(http:/ /www.uniprot.org/)將靶點轉換成為相應的基因名稱,將檢索出的基因合并后匯總,再運用Gephi 0.9.2 軟件構建血必凈成分-靶點網絡。

1.2 血必凈治療COVID-19 靶點的確定

以“ Corona Virus Disease 2019 ”、 “ Novel coronavirus pneumonia” 為 關 鍵 詞, 在 GeneCards(https:/ /www.genecards.org) 數據庫中收集與COVID-19 相關的作用靶點合并后篩重,將血必凈靶點與COVID-19 靶點相映射,得到血必凈治療COVID-19 的作用靶點,并繪制韋恩圖。

1.3 血必凈治療COVID-19 靶點的器官定位

利用BioGPS((http:/ /biogps.org)對血必凈治療COVID-19 靶點進行器官組織定位分析,以高于平均水平確定該靶點所定位的器官或組織,并構建靶點-器官組織定位圖。

1.4 關聯網絡構建與關鍵靶點篩選

在STRING 平臺(https:/ /string-db.org/)導入血必凈靶點并構建靶點群蛋白相互作用網絡(proteinprotein interaction network,PPI network),物種設置為“Homo sapiens” (智 人), 結 果 保 存 后 導 入Cytoscape3.7.0 中分析并篩選關鍵靶點。

1.5 關鍵靶點基因本體GO 與KEGG 信號通路富集分析

分別運用 Omicshare 平臺( http:/ /www.omicshare.com/tools/index.php/)和DAVID v 6.8 平臺(https:/ /david.ncifcrf.gov)對血必凈關鍵靶點進行GO 功能富集與KEGG 信號通路富集,并利用Omicshare 數據庫進行富集點狀圖繪制。

1.6 成分-靶點分子對接

從TCMSP 網站搜索血必凈主要成分結構式,從PDB 數據庫(http:/ /www.rcsb.org/) 下載SARSCoV-2 病毒的3CL 水解酶及其人體受體血管緊張素轉化酶II(ACE2)蛋白結構,運用Mgltools1.5.6 軟件進行加氫、計算電荷等處理后,保存為pdbqt 文件。定義SARS-CoV-2 和ACE2 天然結合配體作為活性口袋,使用Autodock Vina 1.1.2 進行分子對接,取結合能最小的分子用Pymol 和Maestro 11.9 繪制分子對接圖。

2 結果

2.1 血必凈主要成分及主要成分-靶點網絡構建

查閱文獻[5-12]發現血必凈主要成分有阿魏酸、苯甲酰芍藥苷、丹參素、丹酚酸A、芍藥苷、芍藥內酯苷、洋川芎內酯I、原兒茶醛、原兒茶酸等22 種,詳見表1。 在TCMSP 數據庫和SwissTarget Prediction 服務器中獲取22 種主要成分靶點數據,將數據合并、刪重后得到血必凈22 種主要成分作用于370 個靶點,見圖1。

2.2 血必凈治療COVID-19 靶點的獲取與收集

通過GeneCards 數據庫獲得與COVID-19 相關的靶點數目272 個,與血必凈預測靶點相映射并繪制韋恩圖,如圖2 所示,相交集的54 個靶點即為血必凈治療COVID-19 的潛在靶點。

2.3 血必凈治療COVID-19 靶點的器官定位

為明確血必凈作用的主要靶器官,將血必凈治療COVID-19 的54 個靶點導入BioGPS 數據庫,以高于平均水平作為基因定位于某器官或組織的標準,由圖3 可見,血必凈54 個靶點中有47 個靶點位于肺,49 個靶點位于心臟,49 個靶點位于肝,47 個靶點位于全血,33 個靶點位于結腸,24 個靶點定位于小腸,12 個靶點位于氣管,11 個靶點位于腎,8 個靶點位于胰腺。

2.4 血必凈靶點關聯網絡構建及關鍵靶點篩選

將血必凈54 個靶點輸入STRING 數據庫構建基因關聯網絡,如圖4 所示,共有54 個節點、519 條相互作用連線構成關聯網絡。 圖中節點的大小代表度值(Degree)大小,節點越大代表度值越大；節點邊的粗細和顏色代表介數(Betweenness)大小,節點邊越粗且顏色越深代表介數越大。 PPI 關聯網絡的平均度值為19.22,平均介數為1.28×10-2,平均最短距離(Closeness)為6.13×10-1,取均在平均值以上的14 個基因作為血必凈治療COVID-19 的關鍵靶點,詳見表2。

表1 血必凈主要成分基本信息Table 1 Basic information on the main components of Xuebijing

圖1 血必凈主要成分-靶點網絡Figure 1 Xuebijing injection main ingredients - targets network

圖2 血必凈治療COVID-19 的靶點維恩圖Figure 2 Venn diagram of targets in the treatment of COVID-19 with xuebijing injection

2.5 血必凈關鍵靶點GO 功能富集分析

利用OmicShare 云平臺對14 個關鍵靶標進行GO 功能與富集分析,結果顯示生物過程主要涉及生物過程調控、多細胞生物過程、免疫系統過程、細胞增殖、刺激反應、代謝過程、生物過程的調節、解毒等；分子功能及細胞組成主要涉及抗氧化活性、催化活性、細胞膜、細胞突觸、細胞器等,詳見圖5。進一步富集發現血必凈可能是通過參與細胞死亡的調節、脂多糖應答、蛋白質定位調節、細胞對有機物的反應、調節細胞蛋白質代謝過程、分子功能調節、細胞死亡等方面發揮作用,詳見圖6。

2.6 血必凈關鍵靶點KEGG 信號通路分析

依據P＜0.05 篩選14 個關鍵靶點的KEGG 通路,共得到非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer)、甲型流感(Influenza A)、T 細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、 肺 結 核(Tuberculosis)、單純皰疹病毒感染(Herpes simplex infection)、朊病毒疾病(Prion diseases)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、HIF-1 信號通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll 樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK 信號通路(MAPK signaling pathway)、FoxO 信號通路(FoxO signaling pathway)等信號通路。 圖7 為上述20 條信號通路的高級氣泡圖,其中氣泡顏色代表P 值的大小,RichFactor 代表富集的程度大小,氣泡大小代表該通路中目標基因的多少。

2.7 血必凈主要成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶及人體受體ACE2 的分子對接

將血必凈22 個主要成分分別與SARS-CoV-2 3CL 水解酶(PDB ID:6LU7)和ACE2(PDB:1R4L)進行分子對接。 結果如表3 所示,血必凈22 個主要成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶的結合能均小于-5.0 kJ/mol；與ACE2 的對接中,除羥基紅花黃色素A 大于-5.0 kJ/mol 外,其余成分與ACE2 的結合能均小于-5.0 kJ/mol。 圖8 為結合能最小分子的對接圖,金絲桃苷與SARS-CoV-2 3CL 水解酶活性位點附近的LEU 141、GLU 166、ASP 187、THR 26 形成氫鍵,與HIS 41 形成Pi-cation 相互作用；木犀草苷與ACE2 活性位點附近的ALA 348 形成氫鍵、與HIS 345 形成Pi-Pi 相互作用、與HIS 505、ARG 273形成Pi-cation 相互作用。 這些氫鍵及相互作用促使小分子穩定結合到各自蛋白的活性位點上,進而抑制蛋白活性。

圖3 靶點-器官組織定位圖Figure 3 Targets-organ mapping

圖4 血必凈靶點關聯網絡Figure 4 The association network of Xuebijing injection genes

表2 關鍵靶標及其拓撲參數Table 2 The main targets and their topological parameters

圖5 關鍵靶點的GO 功能分析Figure 5 GO function analysis of key target genes

圖6 靶點的GO 富集分析Figure 6 GO enrichment analysis of target genes

3 討論

COVID-19 患者大多表現為為發熱、乏力和干咳等癥狀,預后良好。 但少數重型和危重型患者可快速進展為膿毒癥休克、出凝血功能障礙及多器官衰竭等,往往預后不良[13]。 而研究發現SARS-CoV-2感染導致的免疫反應過激與炎癥因子風暴是上述并發癥產生,以及患者死亡的罪魁禍首[3]。 血必凈注射液是我國被批準治療膿毒癥、全身炎癥反應綜合征及多器官衰竭的中成藥,此藥是根據我國著名中西醫結合急救專家王今達教授提出的"四證四法"中醫治則及"菌毒炎并治"理論,以血府逐瘀湯為基礎,由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸5 味中藥提取物精制而成,臨床上在重癥肺炎、燒傷膿毒癥、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征等危重疾病患者治療方案中廣泛應用[14]。 專家組在總結COVID-19 前期治療經驗的基礎上,于五版診療方案中首次推薦了血必凈,而后六、七版診療方案[13-15]依舊推薦重型和危重型患者使用,再次肯定了血必凈治療COVID-19 的有效性。

為明確血必凈治療COVID-19 的確切機制,本研究挖掘血必凈主要成分的作用靶點,并重點分析了關鍵靶點及其富集的生物過程、信號通路。 結果發現IL6、IL2、TNF、MAPK1、FGF2 等血必凈關鍵靶點中多為免疫、炎癥因子或相關受體,主要參與催化活性、抗氧化活性、細胞增殖等生物功能,以及脂多糖應答、刺激反應、代謝過程、免疫系統進程等生物過程。 關鍵靶點富集的通路主要有T 細胞受體、TNF、HIF-1、PI3K-Akt、MAPK、FoxO 等,其中調控免疫、炎癥的通路為數最多,如調控免疫的T 細胞受體通路；調控炎癥的TNF、MAPK、Toll 樣受體等；而HIF-1 信號通路是眾所周知的機體缺氧應激主要通路；甲型流感感染、單純皰疹病毒感染、朊病毒疾病通路則涉及病毒感染的調控。 諸多實驗研究證實血必凈注射液主要通過抑制TNF-α、IL1、IL6、IL8、IL17 等促炎因子,抑制晚期炎癥細胞因子高遷移率族蛋白B1 (HMGB1) 的表達,抑制Toll 樣受體4(TLR4) /NF-κB 通路的激活發揮抗炎作用[16]。 許月球[17]的meta 分析顯示血必凈注射液能夠改善膿毒癥的免疫功能紊亂,這些都與我們的網絡藥理學研究結果保持了一致。 由此可見,緩和過激的免疫反應,抑制炎癥因子風暴,進而減輕免疫、炎性損傷是血必凈治療COVID-19 的主要機制。

表3 血必凈活性成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2 分子對接結果Table 3 Docking results of the active components of xubijing with SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2

圖7 KEGG 通路富集Figure 7 KEGG pathway enrichment

圖8 SARS-CoV-2 3CL 水解酶與金絲桃苷(1,2)和ACE2 與木樨草苷(3,4)的二維及三維分子對接模式Figure 8 2D and 3D Molecular docking diagram of SARS-CoV-2 3CL hydrolase(1,2)with hyperoside and ACE2 with cynaroside(3,4)

ACE2 是SARS-CoV-2 侵入人體的細胞受體,主要表達于呼吸系統上皮細胞,消化系統吸收性腸細胞、食管、回腸和結腸的上皮細胞中,表明消化系統和呼吸系統是SARS-CoV-2 入侵及損傷的首要器官[18],而臨床上患者在發熱、咳嗽的同時,往往伴有腹瀉、惡心、厭食等消化道癥狀也說明了這一點。房曉偉[19]等分析了79 例COVID-19 患者的臨床特征及實驗室檢查,發現SARS-CoV-2 感染還能造成患者(特別是重型和危重型)凝血系統、心臟、肝、腎等多個器官及系統的全面損傷,提示要積極防治多器官損傷,避免患者由普通型轉化為重型和危重型。 本研究對血必凈治療COVID-19 的54 靶點進行器官定位,發現靶點主要富集在肺、心臟、肝、胰腺、氣管、小腸、結腸、全血、腎等器官,與重型和危重型患者的多器官損傷情形完全吻合,說明血必凈能夠保護多個器官,產生協同治療COVID-19 的作用,同時也再次印證了中醫藥物之間協同作用、整體論治的基本優勢。

SARS-CoV-2 3CL 水解酶是病毒自身的一個關鍵蛋白,病毒需要利用它來復制RNA,被認為是抗SARS-CoV-2 病毒的有效靶點,饒子和/楊海濤課題組測定并提供了SARS-CoV-2 3CL 水解酶的高分辨晶體結構,為抗SARS-CoV-2 活性成分篩選奠定了基礎[20]。 由于ACE2 在介導SARS-CoV-2 入侵細胞、促進病毒復制、加重急性肺損傷方面發揮重要作用,也是潛在的藥物篩選靶點[21-23]。 在AutoDock軟件中,一般以結合能小于-5.0 kJ/mol 為標準,來認定小分子化合物與靶蛋白之間具有較好的親和力[24]。 本文分子對接顯示血必凈22 個主要成分中的絕大數與SARS-CoV-2 3CL 水解酶、ACE2 有較好的親和力,其中與SARS-CoV-2 3CL 水解酶親和力最大是金絲桃苷,與ACE2 親和力最大的是木犀草苷、苯甲酰芍藥苷。 因此,本研究推測血必凈苷類成分可能具有一定的抗病毒潛力。

綜上所述,血必凈治療COVID-19 的機理集中體現在兩個方面,主要是通過調節人體免疫炎癥反應來保護重要器官,其次還可能作用于病毒必需蛋白3CL 水解酶及其人體受體ACE2 而產生一定的抗病毒作用,具有多成分、多靶點、多通路、整體論治的協同優勢。