BALB/c 突變卷毛小鼠肝癌移植模型對比分析

李曉娟,李興杰,馮 帆,孫慧偉,柴燕濤,高 蓉,李 潤,李瑞生*

(1.中國人民解放軍總醫院第五醫學中心,臨床研究管理中心,北京 100039； 2.中國人民解放軍總醫院第五醫學中心,臨床檢驗診療中心,北京 100039； 3.解放軍醫學院,北京 100853)

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一[1],肝癌在全球的死亡率僅次于肺癌和胃癌,位居第三[2-3]。 由于肝癌的危害性逐步上升,全球對肝癌的預防與治療投入了大量的基礎性研究,旨在能夠為肝癌的臨床治療提供基礎依據,其中建立肝癌動物模型是肝癌臨床與基礎研究工作中必不可少的工具[4]。 由于實驗動物的選擇有多種,而小鼠作為又經濟又易操作的實驗動物,常常作為肝癌模型的首選實驗動物。 BALB/c 卷毛小鼠是本實驗室發現的自發突變小鼠,本實驗室對其種子資源進行了純化并展開一系列研究。 前期研究結果提示突變基因對小鼠的免疫器官、血液免疫成分和部分免疫分子均產生了一定的影響[5-6],因此本實驗對BALB/c 突變卷毛小鼠與正常BALB/c 小鼠進行肝癌細胞系皮下移植模型和原位腫塊移植模型構建的比較分析,以期了解突變小鼠與正常小鼠構建模型是否存在差異,同時探討是否由于免疫方面的缺陷而使突變小鼠在腫瘤模型構建中更具有優勢,為今后將該卷毛突變小鼠可能成為更有優勢的肝癌動物模型提供堅實的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 周齡SPF 級KM 小鼠2 只,雌性,18～20 g；5～6 周齡SPF 級BALB/c 小鼠20 只,雌性,16 ～18 g,均購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2016-0002]。 20 只SPF 級5 ～6 周齡卷毛小鼠:20 只,16～18 g,雌性,來源于本實驗室近交培育(全同胞兄妹交配)。 動物飼養在解放軍總醫院第五醫學中心[SYXK(軍)2017-0016]。 飼養環境:溫度22℃～25℃,濕度40%,自由進食和飲水。 本實驗通過了解放軍總醫院第五醫學中心動物倫理委員會審查(IACUC-2017-006)。 在實驗過程中,嚴格按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

H22肝癌細胞株為本實驗室保存。 DMEM 培養基、胎牛血清均購買自美國Hyclone 公司；吸入麻醉劑異氟烷(Isoflurane)購買自深圳瑞沃德公司產品。相差倒置顯微鏡(Olympus,日本)；離心機(Kubota 4200,日本)；游標卡尺(上海臺海工量具有限公司)；手術器械和材料由本實驗室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 皮下腫瘤移植模型建立

將H22肝癌細胞株復蘇后腹腔接種于KM 小鼠體內,7 d 后小鼠腹腔形成含有H22的腹水,無菌抽取腹水于試管中,用生理鹽水洗滌2 次,離心(1000 r/min)5 min,棄上清液,臺盼藍染色計數,用生理鹽水調整癌細胞數至1×107/mL,制備成細胞懸液備用。 小鼠分為兩組:BALB/c 小鼠組(10 只) 和BALB/c 突變卷毛小鼠組(10 只)。 將上述備用肝癌細胞懸液分別注射于兩組小鼠的右側下肢根部皮下,每只0.2 mL,連續觀察7 d,注射部位出現腫瘤組織提示造模成功。

1.3.2 原位腫瘤移植模型建立

將上述備用肝癌細胞注射接種于KM 小鼠的右側大腿根部皮下,生長一周后,解剖將腫瘤剝離,選取腫瘤組織性狀和色澤較好的部分切割成腫瘤組織微塊(直徑0.5 ～1 mm),置于DMEM 培養基中。隨后參考文獻[7]進行手術,建立原位腫瘤移植模型。 術后需觀察各組小鼠的活動狀態,于15 d 后剖腹摘取肝腫瘤。

1.3.3 形態學觀察

使用游標卡尺測量將上述兩種造模方式所得腫瘤均,分別記錄腫瘤的長徑與短徑。 按公式計算腫瘤體積(V):V=a×b2/2 (a 為長徑,b 為短徑)。隨后分別將兩組腫瘤組織置入4%甲醛固定,進行HE 染色,光鏡下對病理形態學進行觀察。

1.4 統計學方法

腫瘤體積的數據采用SPSS 19.0 統計學軟件進行分析,實驗數據均采用平均數±標準差()表示,應用配對t 檢驗進行組間分析比較。 P ＜0.05與P＜0.01 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠皮下腫瘤與肝原位腫瘤外觀對比結果

結果顯示:在相同的時間內,卷毛小鼠和正常小鼠的下肢根部均成功生長腫瘤,正常小鼠的腫瘤體積偏小,且比較扁平；而卷毛小鼠的腫瘤外觀明顯大于正常小鼠,且腫瘤大小較均勻,腫瘤更加立體,多呈三維狀態(見圖1A)。 而在相同的時間內,卷毛小鼠和正常小鼠的肝原位腫瘤也均移植成功。 卷毛小鼠的肝原位腫瘤均顯著大于正常小鼠,且可觀察到腫瘤與周邊的正常肝組織浸潤關系更密切(見圖1B)。

2.2 兩組小鼠皮下腫瘤與肝原位腫瘤體積對比結果

圖1 兩組小鼠皮下腫瘤與肝原位腫瘤外觀對比結果Note.A, Subcutaneous tumor.B, Liver tumor in situ.Figure 1 Comparison of appearance of subcutaneous tumors and liver tumors in situ in two groups of mice

結果顯示:正常小鼠和卷毛小鼠的皮下腫瘤體積分別平均為(55.38±30.98) mm3和(375.78±64.89) mm3,卷毛小鼠的皮下腫瘤體積與正常小鼠相比,具有顯著統計學差異(P＜0.01)；正常小鼠與卷毛小鼠的肝原位腫瘤的體積分別為(3.93±1.99)mm3和(11.91±7.34) mm3,卷毛小鼠的肝原位腫瘤體積也顯著大于正常小鼠(P＜0.05)(見表1)。

2.3 兩種方式移植腫瘤病理形態學比較分析

病理形態學結果可見:正常小鼠肝細胞索結構完整,肝小葉結構清晰,肝細胞胞漿均勻,無壞死和炎性浸潤(見圖2A)。 移植皮下腫瘤后可見:正常小鼠皮下腫瘤組織的巢狀結構有明顯的界線,包裹肌肉的面積較少,浸潤性較輕(見圖2B)。 卷毛小鼠皮下腫瘤與肌肉組織之間沒有清晰的界線,完全融合在一起,侵蝕性較強(見圖2C)。 移植原位腫瘤后可見:正常小鼠的原位腫瘤體積較小,與正常肝組織的交界部位清晰可見,侵入性較弱；而卷毛小鼠原位腫瘤的視野內腫瘤組織幾乎侵蝕了整個肝組織,完全破壞了正常的肝小葉組織,且腫瘤灶內可見瘤細胞深染,排列擁擠雜亂(見圖2D、圖2E)。

表1 兩組小鼠兩種移植腫瘤體積比較( ,n=10)Table 1 Comparison of the volume of two kinds of transplanted tumors between two groups of mice

表1 兩組小鼠兩種移植腫瘤體積比較( ,n=10)Table 1 Comparison of the volume of two kinds of transplanted tumors between two groups of mice

注:動物數為10 只/組,與正常小鼠比較:*P＜0.01,ΔP＜0.05。Note.10 mice each group.Compared with normal mice.* P ＜0.01,ΔP＜0.05.

腫瘤體積(mm3)Tumor volume組別Groups 皮下腫瘤Subcutaneous tumor原位腫瘤Orthotopic tumor卷毛小鼠Curly mice 375.78±64.89* 11.91±7.34Δ正常小鼠Normal mice 55.38±30.98 3.93±1.99

圖2 兩種移植方式腫瘤病理學檢查(HE 染色)Note.A,normal liver.B-C,subcutaneous tumor of normal mice and curly mice,respectively.D-E,liver situ tumor of normal mice and curly mice,respectively.The red arrow shows junction between subcutaneous tumors and muscle tissue.The blue arrow shows junction between in situ tumors and normal liver tissue.Figure 2 Tumor pathological examination in two transplantation modes(HE staining)

3 討論

原發性肝癌是世界范圍內常見和多發的惡性腫瘤之一,其發病率和死亡率均居高不下[8]。 迄今為止,臨床上仍然缺乏行之有效的治療手段,肝癌的治療形勢依然很嚴峻。 因此研究者借助于建立良好的肝癌動物模型用于肝癌發病機制以及藥物治療的研究[9]。 文獻報道常見的建模方式為采用小鼠肝癌細胞系直接移植于小鼠皮下或直接將細胞懸液原位注射于肝[10-12],還有各種原位移植的改良報道[13-14]。 上述兩種建模方式應用廣泛,但各有優缺點,適合應用于不同的研究領域。 而對于應用突變小鼠建立肝癌動物模型,國內尚未見報道。

因此,本實驗在前期研究發現卷毛小鼠具有部分免疫缺陷的基礎上,應用突變卷毛小鼠與正常小鼠同時構建皮下移植腫瘤模型和原位肝移植模型并進行了比較,結果顯示:卷毛小鼠與正常小鼠均造模成功,說明該突變卷毛小鼠具有作為腫瘤移植模型的潛力,而且本實驗應用了腫瘤微組織塊移植肝原位腫瘤,能夠更好的模擬腫瘤生長的微環境,為以后的研究提供高質量的肝癌動物模型。 研究表明卷毛小鼠的皮下移植和原位移植腫瘤不僅體積均顯著大于正常小鼠(P＜0.05),而且腫瘤大小較均勻,腫瘤更加立體,多呈三維狀態,較正常小鼠腫瘤扁平狀要更加適用于研究。 同時卷毛小鼠肝原位腫瘤與周邊的正常肝組織浸潤關系更密切。 病理結果能夠印證這一點:卷毛小鼠皮下腫瘤與肌肉組織之間沒有清晰的界線,完全融合在一起,侵蝕性較強；卷毛小鼠肝原位腫瘤的視野內腫瘤組織幾乎侵蝕了整個肝組織,肝小葉組織已經完全破壞。眾所周知,皮下移植腫瘤屬于異位移植,多用于抗腫瘤藥物藥效學的初步研究,而肝癌的原位移植相較于異位移植能夠更好地模擬肝癌細胞在組織中與細胞以及組織間隙相互作用的狀況,同時肝癌細胞在組織中的血供與生長環境也更加接近于人體內發生發展的過程,因此能夠更好地反映出肝癌發病機制分子生物學研究的特性[15]。 而本實驗眾多結果均顯示卷毛小鼠的肝癌成模均優于正常小鼠。下一步我們將對肝癌腫瘤形成機制及抗腫瘤藥效學對模型進行評價研究。

綜上所述,BALB/c 突變卷毛小鼠在形成肝癌皮下移植腫瘤和肝臟原位移植腫瘤的能力顯著優于正常BALB/c 小鼠,我們有理由推斷由于突變基因引起的部分免疫缺陷使該突變小鼠更易于成模,未來預期可將該突變卷毛小鼠應用于肝癌動物模型的各項研究中,本實驗為我們進一步利用肝癌動物模型開展各項研究提供了很好的實驗平臺,也將該突變卷毛小鼠應用于新的研究領域提供堅實的理論支持。