參附注射液對大鼠心肌缺血再灌注期間的心電圖演變過程的影響及作用機制研究

鄧鳳珠,馮 沖,李春富,符海燕,李天發

(1.海南西部中心醫院心電圖室, 海南 儋州 570125； 2.海南西部中心醫院心內科, 海南 儋州 570125；3.中山大學附屬第一醫院心內科, 廣州 510080)

缺血性心臟病是臨床常見心血管疾病,其發病率和致死率均較高,臨床常見為急性心肌梗死、冠心病、心絞痛等[1]。 缺血性心臟病早期再灌注是其治療的重要手段之一,但在心肌恢復血流灌注過程中常出現繼發性損傷,易發生室性心動過速( ventriculartachycardia, VT )、 心 室 顫 動(ventricularfibrillation,VF)等并發癥,是導致缺血再灌注期間患者猝死的重要原因[2-3]。 因此,尋找毒副作用少、療效穩定的藥物對減少心肌缺血再灌注損傷有重要意義。 參附注射液由中藥紅參、黑附片提取配置而成,具有改善微循環、提高機體缺氧耐受能力的作用。 目前,臨床已有關于參附注射液對心肌缺血再灌注損傷及心肌保護作用的報道[4],但關于其對心肌缺血再灌注損傷期間心電圖變化的影響及調控機制研究尚少。 本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型,探討參附注射液對大鼠心肌缺血再灌注期間的心電圖演變過程的影響及作用機制,為參附注射液臨床合理用藥提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠,50 只,10 周齡,體重200～240 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2018-0001]；動物飼養于中山大學[SYXK(粵)2019-0209]；實驗研究過程中做到了替代、減少、優化的3R 原則,實驗經中山大學實驗動物倫理委員會審批(IACUC20180901-1)。

1.2 主要試劑與儀器

參附注射液(華潤三九(雅安)藥業有限公司,國藥準字Z51020664,規格10 mL,貨號180621)；TUNEL 檢測試劑盒(美國Roche 公司, 貨號:1884817)；逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa 公司,貨號:D6110A)；二喹啉甲酸(diquinolinicacid,BCA)蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo 公司,貨號:23227)；兔抗鼠蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylatedAkt,p-Akt)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(phosphorylatedGSK-3β,p-GSK-3β)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapain target protein,mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)多抗(一抗,美國Abcam 公司, 貨 號: ab38449、 ab8805、 ab93926、 ab75745、ab141405、ab109268)；山羊抗兔Akt、GSK-3β、mTOR、p-mTOR 單抗(二抗,英國Abcam 公司,貨號:ab8933、ab32391、ab2732、ab84400)。 ECG-6511 型心電圖儀(上海光電醫用電子儀器有限公司)；TK77-TKr-200C型小動物呼吸機(北京中西遠大科技有限公司)；3550UV 酶標儀、7500 實時熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司)；電泳儀、CheniDocXRS 化學發光成像分析系統(美國Bio-rad 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及給藥方法

取50 只大鼠,按體重排序隨機分為5 組:假手術組、模型組、參附低、中、高劑量組,各10 只；假手術組:左冠狀動脈前降支穿線、不接扎,穿線前10 min 股靜脈推注2 mL/100 g 注射用生理鹽水；模型組:缺血前10 min 股靜脈推注2 mL/100 g 注射用生理鹽水；參附低、中、高劑量組分別在缺血前10 min股靜脈推注1、2、4 mL/100 g 參附注射液。

1.3.2 心肌缺血再灌注模型制備

術前12 h 禁食不禁水,以1 g/kg 腹腔注射20%烏拉坦進行麻醉,仰臥位固定大鼠,連接動物呼吸機,給予正壓通氣(呼吸頻率55～60 次/分、潮氣量2 mL/100 g)；針式電極固定于四肢,連接心電圖儀檢測標準肢體Ⅱ導聯心電圖,棄去心電圖異常者；于左胸第三、四肋間做縱向切口,暴露心臟,用6-0 縫合線從左心耳根(左冠狀動脈前降支)穿過,將直徑2.0 mm 的硅膠管防止于縫合線下方,除假手術組外,其余各組均立即結扎,以心電圖出現ST 弓背向上型抬高、QRS 波變寬振幅加大,提示結扎成功。結扎30 min 后進行持續再灌注90 min,全程心電檢測,記錄Ⅱ導聯心電圖(50 mm/s、增益1 mV=10 mm)及VT、VF 心律失常發生情況。 除模型組、參附低劑量組各有1 只大鼠死亡外,其余均造模成功。

1.3.3 心肌細胞凋亡測定

采用TUNEL 法檢測各組心肌細胞凋亡情況。灌注結束后立即取大鼠心臟組織,切取冠狀動脈前降支全層,放置于10%中性甲醛中,經過脫水、包埋后,用切片機切成厚度為4 μm 的切片,后經脫蠟、水化,PBS 洗滌晾干,加入蛋白酶K 溶液孵育20 min,PBS 再次洗滌晾干,每張TUNEL 檢測液50 μL,37℃避光孵育60 min,PBS 洗滌3 次后,滴加抗熒光淬滅封片液50 μL,蓋上蓋玻片,于顯微鏡下觀察細胞染色情況,每張切片隨機取5 個視野,以細胞染色為棕色或棕紅色判定為陽性細胞,凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.3.4 心肌組織中Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、mTOR、p-mTOR 蛋白表達水平檢測

取大鼠心臟冠狀動脈前降支部分組織,液氮中研磨后,加入0.5 mL 細胞裂解液,冰上孵育30 min,4℃12000 r/min 離心10 min(離心半徑10 cm),收集上清液,BCA 法進行蛋白定量,取40 μg 樣本進行SDS-PAGE 分離,電轉儀電轉1 min,加入封閉液搖床封閉2 h,TBST 洗滌10 min×3 次,加入稀釋一抗,Akt (1 ∶500)、p-Akt (1 ∶500)、GSK-3β (1 ∶1000)、p-GSK-3β (1 ∶500)、mTOR (1 ∶1000)、p-mTOR (1 ∶500),4℃孵育過夜,加入稀釋二抗(1 ∶10000),常溫孵育2 h,于暗室中曝光、顯影,用凝膠成像系統掃描并用Image J 圖像分析軟件進行灰度值分析,以目的蛋白與內參β-actin 灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件分析數據,計量資料以平均數±標準差()表示,多樣本計量資料比較采用單因素方差分析,兩兩樣本比較采用SNKq 檢驗。 P＜0.05 為差異有統計學意義。 多組間計數資料采用整體卡方檢驗,兩兩比較檢驗水準α′需校準,α′ = α/[k×(K-1)/2],其中k 為組數,α=0.05。

2 結果

2.1 心肌缺血再灌注不同時間點心電圖ST 段變化比較

缺血前各組心電圖ST 段比較差異無統計學意義(P＞0.05),缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 各組心電圖ST 段比較,差異有統計學意義(P＜0.05)；與假手術組比較,模型組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心電圖ST 段明顯抬高(P＜0.05)；與模型組比較,參附低、中、高劑量組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min心電圖ST 段明顯降低(P＜0.05)；與參附低、中劑量組比較,參附高劑量組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心電圖ST 段明顯降低(P＜0.05)；參附低劑量組與中劑量組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心電圖ST 段比較無明顯差異(P＞0.05)。 見表1。

2.2 心肌缺血再灌注后VT、VF 發生率比較

缺血30 min 及再灌注90 min 期間假手術組大鼠均無VT、VF 發生；模型組及參附低、中、高劑量組缺血30 min 及再灌注90 min 期間VT、VF 發生率比較,差異均有統計學意義(P＜0.05)；缺血30 min 參附中、高劑量組VT、VF 發生率均低于模型組(P ＜0.01)；再灌注90 min 參附高劑量組VT、VF 發生率均低于模型組(P＜0.01)。 見表2。

2.3 心肌細胞凋亡指數比較

假手術組、模型組及參附低、中、高劑量組心肌細胞凋亡指數分別為(1.18±0.36)%、(58.34±6.20)%、 (47.21 ± 5.32)%、 (41.60 ± 5.13)%、(35.46±4.57)%,心肌細胞凋亡指數組間比較,差異有統計學意義(F=202.286,P＜0.001)；與假手術組比較,模型組心肌細胞凋亡指數升高(t=29.195,P＜0.001)；與模型組比較,參附低、中、高劑量組心肌細胞凋亡指數均降低(t=4.087、6.054、9.224,P＜0.001)；與參附低劑量組比較,參附中、高劑量組心肌細胞凋亡指數均降低(t = 2.339、5.180,P =0.032、＜0.001)；與參附中劑量組比較,參附高劑量組心肌細胞凋亡指數降低(t=2.826,P=0.011)。見圖1。

2.4 心肌組織中Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、mTOR、p-mTOR 蛋白相對表達量比較

心肌組織中p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相對表達量組間比較,差異均有統計學意義(P ＜0.05)；與假手術組比較,模型組p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相對表達量均升高(P＜0.05)；與模型組比較,參附低、中、高劑量組p-Akt、p-GSK-3β 及pmTOR 蛋白相對表達量均降低(P＜0.05)；與參附低劑量組比較,參附中、高劑量組p-Akt、p-GSK-3β 及p-mTOR 蛋白相對表達量均降低(P＜0.05),且參附高劑量組低于參附中劑量組(P＜0.05)。 心肌組織中Akt、GSK-3β、mTOR 蛋白相對表達量組間比較,差異無統計學意義(P＜0.05)。 見圖2A、圖2B。

表1 心肌缺血再灌注不同時間點心電圖ST 段變化比較Table 1 Comparison of changes in ST segment of myocardial ischemia reperfusion at different times

表2 心肌缺血再灌注后VT、VF 發生率比較(%)Table 2 Comparison of the incidence of VT and VF after myocardial ischemia and reperfusion

圖1 TUNEL 染色檢測心肌細胞凋亡情況Note.A, Sham operation group.B, Model group.C, Shenfu low dose group.D, Shenfu middle dose group.E, Shenfu high dose group.Figure 1 TUNEL staining to detect myocardial apoptosis

圖2 心肌組織中蛋白表達Note.A, Western blot electrophoresis.B, Quantitative analysis of protein in myocardial tissue.Compared with sham group, aP＜0.05.Compared with model group, bP＜0.05.Compared with Shenfu low dose group, cP＜0.05.Compared with Shenfu middle dose group, dP＜0.05.Figure 2 Protein expressions in myocardial tissue

3 討論

臨床中缺血性心臟病以血管再通術為主要治療手段,但治療過程中往往存在心肌缺血再灌注損傷,易引發心肌出現一系列病理性改變,表現為心肌收縮功能異常、細胞超微結構改變、心肌無復流等現象[5-6]。 引起心肌缺血再灌注損傷機制十分復雜,可能與炎癥細胞浸潤、自由基生成、鈣離子超載及心肌細胞凋亡等多方面有關。 研究顯示,心肌缺血后,患者心電圖ST 段異常抬高程度與疾病嚴重程度呈正相關[7],應用心電圖演變過程評價心肌缺血再灌注損傷的變化有重要意義。 目前,中藥在治療心肌缺血再灌注損傷方面具有多靶點、多層次、整體論治等多種優勢,已成為臨床研究的熱點[8-9]。參附注射液方源“參附湯”名方,在缺血再灌注損傷的保護方面具有確切作用[10],通過心電圖演變過程評價參附注射液對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的改善作用有重要意義。

本研究發現,與假手術組比較,模型組缺血后10 min、30 min 及再灌注10 min、90 min 心電圖ST段明顯抬高,說明心肌缺血再灌注大鼠造模成功。應用不同劑量參附注射液干預后,大鼠缺血及再灌注不同時間點心電圖ST 段明顯降低,且存在劑量依賴性,缺血后30 min 參附中、高劑量組VT、VF 發生率均低于模型組,提示參附注射液可有效改善心肌缺血再灌注損傷心電圖變化,降低心律失常發生率。 進一步進行TUNEL 染色發現心肌細胞凋亡指數與心電圖ST 段趨勢一致,證實參附注射液可有效抑制心肌細胞凋亡。 參附注射液由紅參、黑附片提取液制備而成,紅參具有活血化瘀、益氣安神的功效,紅參中含有人參皂苷Rg、Rb,具有較強清除氧自由基[11]；附片具有擴張血管尤其是對冠脈具有較強的擴張作用[12]。 參附注射液中紅參與黑附片共同作用,在擴張血管的同時清除氧自由基,發揮抑制心肌細胞凋亡的作用。

此外,本研究中,模型組心肌組織中p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR 蛋白相對表達量均高于假手術組；與模型組比較,參附低、中、高劑量組心肌組織中p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR 蛋白相對表達量均降低,且呈劑量依賴性,提示參附注射液對心肌缺血再灌注損傷的改善作用可能與抑制Akt/GSK-3β 信號通路激活有關。 缺血再灌注損傷是導致細胞凋亡的主要原因,Akt/GSK-3β/mTOR 信號通路是介導細胞凋亡的重要通路[13-14]。 Akt 在缺血后再灌注早期則處于激活狀態,其上游PI3K 受到胞外信號刺激后,介導Akt分子發生膜轉位,繼而磷酸化激活進入細胞內,繼而將信號傳遞至mTOR 啟動靶點TOR 復合體1,激活后的mTOR 參與心肌細胞凋亡過程[15-16]。 本研究應用的參附注射液含有紅參提取液,紅參屬于益氣活血養陰類中藥,已有研究證實此類中藥具有改善心肌缺血再灌注損傷、調節PI3K/Akt 信號通路的作用。 由此可知,參附注射液對心肌缺血再灌注損傷的改善作用可能與抑制Akt/GSK-3β 信號通路激活有關。

綜上所述,參附注射液可有效改善心肌缺血再灌注損傷心電圖變化,降低心律失常發生率,抑制心肌細胞凋亡,可能與抑制Akt/GSK-3β 信號通路激活有關,為參附注射液的臨床應用提供理論支持,但關于參附注射液是否存在其他調控通路改善心肌缺血再灌注損傷有待進一步研究。