血液分析儀與手工計(jì)數(shù)法在實(shí)驗(yàn)樹鼩紅細(xì)胞生理指標(biāo)檢測中的效果評價

馮清源,馮一唯,夏 巍,戢克銅,陳泓霖,賴永靜,唐安洲

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530000)

樹鼩是一種小型哺乳類動物,在我國云南、廣西、貴州、海南等地均有分布[1]。 樹鼩具有體型小、易飼養(yǎng)、繁殖周期短、管理便捷等特點(diǎn),在解剖結(jié)構(gòu),生理功能與生化代謝方面與人類有諸多相似之處[2-3],并且全基因組測序結(jié)果證實(shí)了樹鼩與靈長類動物具有高度親緣關(guān)系[4]。 基于這些優(yōu)勢,近年來樹鼩作為實(shí)驗(yàn)動物被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,并取得了豐碩的成果[5-8]。

目前有關(guān)樹鼩的研究多為應(yīng)用型研究,較少見有關(guān)于樹鼩自身生理指標(biāo)測量方面的報(bào)導(dǎo),隨著樹鼩的廣泛使用,其正常生理指標(biāo)的系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化將變得至關(guān)重要。 血常規(guī)檢查簡便、快捷,對機(jī)體內(nèi)許多病理改變都有敏感反映[9-12],是動物造模中最常用的檢查指標(biāo)之一。 雖已有學(xué)者對實(shí)驗(yàn)樹鼩的血象進(jìn)行了初步研究[13-20],但尚未見有通過手工法對樹鼩紅細(xì)胞相關(guān)生理值進(jìn)行測定的報(bào)導(dǎo),同時由于不同研究中使用的血細(xì)胞分析儀型號和廠商不同,導(dǎo)致分析系統(tǒng)的原理和方法不盡相同,而使得不同的研究結(jié)果之間一致性較差,例如:馬旭通等[19]使用美國雅培CELL-DYN3700 全自動血球分析儀測量的人工繁育樹鼩紅細(xì)胞數(shù)量(1012/L)和血紅蛋白含量(g/L)分別為(7.99±0.92)和(149.2±15.5)；而李進(jìn)濤等[20]利用貝克曼庫爾特DifF-2 型全自動血細(xì)胞分析儀測量中緬滇西亞種樹鼩的結(jié)果分別為(9.8±0.6)和(174.8±11.04)；而白繼麗等[18]利用BC-2800Vet 全自動血液細(xì)胞分析儀測量人工飼養(yǎng)樹鼩的結(jié)果為(8.21±0.96)和(150.12±13.60)。 以上研究中樹鼩的種屬來源有一定差異,此外,馬旭通等[19]測量了野生樹鼩不同性別紅細(xì)胞數(shù)量,結(jié)果分別為(7.93±0.59)(雌)、(6.97±2.15)(雄),因此,樹鼩種屬來源以及性別的不同也可能是導(dǎo)致研究結(jié)果差異的影響因素。 同時,血液分析儀較手工法測量血液生理指標(biāo)有可能存在一定誤差,2012 年,Zandecki 等[21]詳細(xì)分析了血液分析儀的誤差可能,脂質(zhì)、凝集素、冷球蛋白和白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高等會導(dǎo)致血紅蛋白測量或紅細(xì)胞計(jì)數(shù)異常,這些測量指標(biāo)的異常同時可能導(dǎo)致計(jì)算出的平均紅細(xì)胞指數(shù)也受到影響。 為了對血細(xì)胞分析儀測定結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行分析,本研究對實(shí)驗(yàn)室繁殖樹鼩外周血中紅細(xì)胞生理值指標(biāo)數(shù)值進(jìn)行了手工檢測,并與不同血液細(xì)胞分析儀的結(jié)果進(jìn)行對比,旨在為今后的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

普通級成年中緬樹鼩滇西亞種20 只,雌雄各半,體重為120～130 g 之間,由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SCXK(滇)K2019-0005],在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(桂)2014-0003]穩(wěn)定4周以上。 普通級樹鼩飼養(yǎng)房,單籠喂養(yǎng), 室內(nèi)溫度(24±1)℃,相對濕度40%～50%,人工光照12 h/d。每日上午10 點(diǎn)清理糞便并投喂全營養(yǎng)顆粒飼料及谷物,隔天投喂水果, 每周投喂面包蟲1 次,自由正常飲水。 實(shí)驗(yàn)時處于樹鼩非繁殖期。 實(shí)驗(yàn)動物的使用經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)動理倫理委員會的批準(zhǔn)(20190921),實(shí)驗(yàn)過程中按照3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

使用邁瑞B(yǎng)C-6800 型全自動血液細(xì)胞分析儀(邁瑞,深圳)和優(yōu)利特URIT-3010 型全自動血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)儀(優(yōu)利特,桂林)進(jìn)行血液細(xì)胞分析測定,檢測試劑為原裝配套試劑。 血紅蛋白測試液、游離血紅蛋白測試盒均購自南京建成生物工程研究所；BX53F 正置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯,日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血樣的采集

禁食12 h 后將樹鼩置于專用的樹鼩保定袋中固定,清醒狀態(tài)下經(jīng)股靜脈抽取2 ～2.5 mL 全血,采血時間控制在30 s 以內(nèi),動作輕柔,盡量避免溶血。將收集到的血液置于含有EDTA 抗凝劑的采血管中并混勻,同時取4 μL 血于干凈載玻片上,制備薄厚適宜且細(xì)胞分布均勻的血涂片。

1.3.2 檢測方法

嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序使用邁瑞B(yǎng)C-6800 型全自動血液細(xì)胞分析儀和優(yōu)利特URIT-3010 型全自動血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)儀測定血液細(xì)胞,得到包括紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血細(xì)胞比容(HCT)、血紅蛋白含量(Hb)、紅細(xì)胞平均容積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)等血液生理指標(biāo)。 手工法測量血細(xì)胞比容原理為微量比容法,紅細(xì)胞直徑的測量和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；使用正置光學(xué)顯微鏡及其配套軟件進(jìn)行血涂片鏡檢；血紅蛋白含量、游離血紅蛋白(FHB)含量檢測使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒通過HICN 比色法測得。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 25.0 軟件包分析數(shù)據(jù),各項(xiàng)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”()表示,參考值范圍的計(jì)算方法則根據(jù)數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布決定,若符合正態(tài)分布,則進(jìn)一步計(jì)算中位數(shù)(median) 和95% CI(confidence interval,置信區(qū)間),統(tǒng)計(jì)判斷:正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用t 檢驗(yàn),非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn),P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 采用Medcalc 7.0 和GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制Bland-Altman 圖和Passing-Bablok 回歸分析,評估兩種方法的一致性。基于Passing-Bablok 回歸分析所獲得的截距和斜率來判斷方法的一致性:若截距和斜率的95%置信區(qū)間(CI)分別包括0 和1,則兩方法一致性好；若截距和斜率的95%置信區(qū)間(CI)未分別包括0 和1,則兩方法一致性差。 基于Bland-Altman 圖上的點(diǎn)在一致性界限(limits of Agreement, LoA)的分布情況,均勻分布于Y=0 的兩側(cè),判斷兩種方法是否存在系統(tǒng)差異；基于兩方案總體平均差、總體截距和斜率的95%CI 是否包括0,判斷兩種方法是否存在比例差異。

2 結(jié)果

表1 記錄了樹鼩外周血中紅細(xì)胞數(shù)、血細(xì)胞比容、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞平均容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度的手工法和血液細(xì)胞分析儀的測量結(jié)果。 手工法中紅細(xì)胞平均容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量和紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度依據(jù)所測得紅細(xì)胞數(shù)、血細(xì)胞比容和紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度的結(jié)果結(jié)合公式計(jì)算得來。可見手工法和五分類血液細(xì)胞分析儀的結(jié)果中僅有血細(xì)胞比容和紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異,其余各項(xiàng)指標(biāo)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；三分類血液細(xì)胞分析儀的結(jié)果僅有紅細(xì)胞計(jì)數(shù)一項(xiàng)與手工法結(jié)果之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余各項(xiàng)指標(biāo)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 圖1 和圖2 以Bland-Altman 圖和Passing-Bablok 回歸分析評估了手工法和血液細(xì)胞分析儀兩種方法的一致性,結(jié)果顯示在使用五分類血液細(xì)胞分析儀檢測HCT 和MCH 時,Bland-Altman圖上的點(diǎn)分布于Y=0 的兩側(cè)且總體平均差、總體截距和斜率的95%CI 均包括0,同時Passing-Bablok 回歸分析截距和斜率的95%CI 分別包括0 和1,因此兩種方法之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且方法之間一致性好,不存在系統(tǒng)誤差和比例誤差；在檢測紅細(xì)胞數(shù)、Hb、MVC、MCHC 時,Bland-Altman 圖上的點(diǎn)較為均勻分布但偏向于Y=0 上側(cè)或下側(cè),且部分參數(shù)的總體平均差、總體截距或斜率的95%CI 不包括0,Passing-Bablok 回歸分析截距的95%置信區(qū)間(CI)不包括0 或斜率的95%置信區(qū)間(CI)不包括1,因此兩種方法之間的一致性一般,存在較大的系統(tǒng)差異和一定的比較差異,提示使用五分類血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測時僅能對上述指標(biāo)變化趨勢進(jìn)行判斷；三分類血液細(xì)胞分析儀的檢測結(jié)果中,紅細(xì)胞數(shù)與手工法比較,Bland-Altman 圖上的點(diǎn)均勻分布于Y=0 的兩側(cè)且總體平均差、總體截距和斜率的95%CI 包括0,同時Passing-Bablok 回歸分析截距和斜率的95%CI 分別包括0 和1,無系統(tǒng)差異和比例差異,但其余各項(xiàng)指標(biāo)均存在較大的系統(tǒng)差異和比例差異,提示該型儀器的檢測結(jié)果與真實(shí)值之間存在較大差異。 手工法檢測樹鼩外周血中游離血紅蛋白的測量結(jié)果為(79.27±6.95),95%CI 為76.02～82.52,有一定參考意義。 圖3 使用正置光學(xué)顯微鏡及其配套軟件對血涂片上合適區(qū)域的樹鼩紅細(xì)胞直徑進(jìn)行檢測得到外周血紅細(xì)胞直徑曲線,可見直徑在5.5～6 μm 之間的紅細(xì)胞最多,偶見過大或過小的紅細(xì)胞。

表1 手工法與血細(xì)胞分析儀檢測樹鼩紅細(xì)胞生理值結(jié)果Table 1 Manual counting and hematology analyzer method to measure the physiological indexes of tree shrew erythrocytes

3 討論

本研究使用手工法及儀器法分別對樹鼩外周血紅細(xì)胞數(shù)、血細(xì)胞比容、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞平均容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度指標(biāo)進(jìn)行測量比較,手工法測定得到的紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量介于三分類儀器法和五分類儀器法之間,高于三分類而低于五分類。 手工測量血細(xì)胞比容使用微量離心法,與本文五分類全自動血液分析儀測定的數(shù)據(jù)比較來看,數(shù)值較為接近,無顯著差異(P=0.104)。 測量過程中血漿滲透壓的改變對血細(xì)胞也會有一定影響[22]。 血細(xì)胞比容能夠反映出紅細(xì)胞與血漿容量的相對關(guān)系,故而血漿容量對其有明顯影響,紅細(xì)胞體積也有一定的影響。 由于所檢測的紅細(xì)胞數(shù)量多,血細(xì)胞比容有可能受到血漿容量發(fā)生改變及紅細(xì)胞體積的變化而有所差異。 手工法與五分類儀器法測得數(shù)據(jù)中紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞平均容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度及血紅蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.001)；手工法與三分類儀器法測得的數(shù)據(jù)中血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞平均容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量紅細(xì)胞、平均血紅蛋白濃度及血紅蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。 本研究中所使用的優(yōu)利特血細(xì)胞分析儀采用電阻抗的原理對紅細(xì)胞及血小板進(jìn)行計(jì)數(shù),而邁瑞血細(xì)胞分析儀是采用電阻抗加激光的原理。 當(dāng)血細(xì)胞通過計(jì)數(shù)孔時會產(chǎn)生脈沖信號,而脈沖數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量呈正比、脈沖的高度與通過其的血細(xì)胞體積的大小成正比[23],通過將脈沖的高度疊加換算得到血細(xì)胞比容,因此儀器并不能區(qū)分不同血細(xì)胞之間的理化性質(zhì)[24],對于小體積紅細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)易混淆,導(dǎo)致出現(xiàn)誤差。 同時,不同物種之間正常血細(xì)胞及蛋白的特性有一定差異,如正常人外周血紅細(xì)胞直徑在6～8 μm 之間,對比手工法測量的樹鼩紅細(xì)胞直徑(圖3),正常人紅細(xì)胞直徑略大于樹鼩,在使用未經(jīng)過數(shù)據(jù)校正的血液分析儀對樹鼩外周血進(jìn)行檢測時可能存在一定的偏差,針對這些差異,在使用血液細(xì)胞分析儀時應(yīng)進(jìn)行參數(shù)的調(diào)整。 并且,手工法在顯微鏡下針對細(xì)胞及特殊成分的計(jì)數(shù)依然是最可靠的檢查方法[25],應(yīng)結(jié)合手工法的結(jié)果對血液細(xì)胞分析儀的參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

同時,本文還首次使用手工法測量了樹鼩外周血中游離血紅蛋白的含量,游離血紅蛋白能夠提示紅細(xì)胞的溶血情況,溶血程度對于其相關(guān)生理指標(biāo)的檢測有明顯影響,游離血紅蛋白含量對于紅細(xì)胞及血紅蛋白相關(guān)指數(shù)的測量準(zhǔn)確性有較好的提示作用,能夠?yàn)槲磥磉M(jìn)一步研究提供參考。 紅細(xì)胞平均指數(shù)由血細(xì)胞比容、血紅蛋白量及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)間接計(jì)算得出,為避免誤差,本文手工法測定這三個指標(biāo)使用同一份抗凝血標(biāo)本。 無論手工法或儀器法,都應(yīng)注意盡可能避免發(fā)生溶血。

圖1 Bland-Altman 圖的x 軸表示手工法與血液細(xì)胞分析儀的平均值,y 軸表示兩種方法結(jié)果之間的差異Note.Manual counting and BC-6800, RBC,MCH, The points on the Bland Altman are distributed on both sides of Y=0,and the 95% CI of the total mean deviation, total intercept and slope includes 0.HCT, Hb, MVC, MCHC, The points on the Bland Altman are more evenly distributed but tend to the upper or lower side of Y=0, and the 95% CI of the overall mean deviation, overall intercept or slope of some parameters does not include 0.Manual counting and UNIT-3010, RBC, The points on the Bland Altman are distributed on both sides of Y=0, and the 95% CI of the total mean deviation, total intercept and slope includes 0.HCT, Hb, MVC, MCH, MCHC, The points on the Bland Altman are more evenly distributed but tend to the upper or lower side of Y=0, and the 95% CI of the overall mean deviation, overall intercept or slope of some parameters does not include 0.Figure 1 The x-axis of Bland Altman graph represents the average value of manual method and hematology analyzer, and the y-axis represents the difference between the results of the two methods

圖2 Passing-Bablok 回歸分析顯示了手工法與細(xì)胞分析儀獲得的數(shù)據(jù)之間的一致性Note.Manual counting and BC-6800.RBC,MCH,95% CI of intercept and slope of Passing-Bablok regression analysis includes 0 and 1 respectively.HCT, Hb, MVC, MCHC, The intercept 95% CI of Passing-Bablok regression analysis does not include or the slope 95% CI does not include 1.Manual counting and UNIT-3010, RBC, 95% CI of intercept and slope of Passing-Bablok regression analysis includes 0 and 1 respectively.HCT, Hb, MVC, MCH, MCHC, The intercept 95% CI of Passing-Bablok regression analysis does not include or the slope 95% CI does not include 1.Figure 2 Passing-Bablok regression analysis shows the consistency between the data obtained by manual method and cell analyzer

本研究選用健康成年樹鼩20 只, 清醒狀態(tài)下空腹股靜脈采血,并及時處理所得樣本, 所選用儀器均有質(zhì)量控制保證,其測定結(jié)果有一定參考意義。 所有樣本結(jié)合傳統(tǒng)血涂片法并進(jìn)行顯微鏡下分類計(jì)數(shù)。 綜上所述,采用電阻抗加激光為原理的五分類全自動血液分析儀測定紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)具有準(zhǔn)確、快速、可靠的優(yōu)點(diǎn),適用于對大批量標(biāo)本進(jìn)行快速有效的檢測,但是其并不能完全替代人工鏡檢法,只有兩者結(jié)合應(yīng)用才能保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；單純以電阻抗為原理的三分類全自動血液分析儀的檢測結(jié)果與真實(shí)值有較大差異,應(yīng)針對樹鼩進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的校正。

圖3 樹鼩外周血紅細(xì)胞直徑曲線Note.The diameter of red blood cells in the right area of the blood smear was measured under an optical microscope using software.Figure 3 Diameter curve of peripheral blood erythrocytes in the tree shrew