母乳中細菌種類及其檢測方法

王雯丹，董彩霞，劉 彪，蔭士安

(1.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，伊利母嬰營養研究院，北京 100022；2.甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730000；3.中國疾病預防控制中心營養與健康所，北京 100050)

近年來越來越多的研究報道，不管是全母乳還是混合喂養，對于嬰兒腸道菌群的組成與定植以及腸道免疫功能的啟動與成熟均非常重要；且母乳喂養與嬰兒糞便中高豐度雙歧桿菌的數量顯著相關；停止(或過早停止)母乳喂養將導致以厚壁菌門為標志的嬰兒腸道微生態的快速成熟[1]。母乳喂養是與嬰兒腸道菌群早期形成關聯最密切的因素。本文綜述了母乳中存在的細菌種類及檢測方法等。

1 母乳中的細菌種類及數量

由于傳統觀點認為人乳清潔無菌，使得人乳中細菌成分以及在嬰兒腸道成熟與免疫功能建立方面的重要作用長期被忽視。近二十年的研究結果表明，母乳喂養持續不斷地為嬰兒腸道提供共生菌、互生菌和/或益生菌。這些發現也讓人乳微生物組學的研究成為近年來關注和研究的熱門領域。

2013年，Martin等學者在健康母親的乳汁中通過滅菌采樣方法，首次發現人乳中存在乳酸菌(非外源性污染)，確認人乳中存在非致病菌；隨后已發現人乳中超過200多種不同的微生物(屬于50種不同菌屬)[2]，個體間差異相當大[3-5]，且受檢測技術的影響。影響母乳菌群組成的因素主要有：母親自身因素，包括體重、過敏史、膳食、免疫狀態等；產后因素，包括分娩方式、孕齡、母親抗生素類藥物使用、哺乳期等[6-7]；此外，喂養方式、人乳寡糖的含量、地域環境等都可能影響母乳的菌群結構[8-10]。

人乳是嬰兒腸道細菌的主要來源。按嬰兒每天攝入約800mL母乳計算，母乳喂養兒攝入約十萬到一千萬的細菌。這也能解釋為何母乳喂養嬰兒的腸道菌群與其母親乳汁中發現的菌群組成密切相關[11]。母乳也是母乳喂養兒共生菌和益生菌的來源，包括葡萄球菌、乳酸菌和雙歧桿菌、鏈球菌、棒狀桿菌等[12]，其中乳酸菌和雙歧桿菌被認為是益生菌[13]。人乳基因組分析結果顯示，人乳微生物群主要由葡萄球菌、假單胞菌和愛德華氏菌占主導，也含少量其他菌種[14-15]。

Sakwinska等[16]匯總了人乳微生物檢測結果，有相似結論，即人乳中微生物群主要由共生的葡萄球菌(如表皮葡萄球菌和鏈球菌)組成。Togo等[17]梳理了人乳微生物文獻，包括38個國家/地區的242篇論文，涉及10 000多名母親的15 000多份乳房與母乳微生物采樣樣本。共發現820個微生物物種，主要是變形菌門和厚壁菌門，出現頻次降序排列為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌等。

2 母乳中細菌種類的文獻綜述

Latuga等[6]匯總了用培養基和生物學方法發現的母乳中常見細菌(表1)；Fernandez等[11]梳理了文獻報道的采用傳統細菌分離或DNA檢測手段的研究(表2)；基于不同國家/地區的人乳中檢測到的細菌種類總結于表3。

表1 用培養基和生物學方法發現的母乳中常見細菌種類

表2 用傳統細菌分離或DNA檢測發現的母乳中常見細菌種類

續表2

表3 不同國家報告的母乳中常見的細菌種類

3 母乳中細菌的檢測方法

目前對母乳菌群的研究仍處于初期，早期檢測方法是用傳統培養基將獲取的母乳樣品進行培養和分離。由于絕大多數現場采集的人體樣品中，微生物無法直接進行體外人工培養，因此在DNA測序技術，特別是宏基因組技術成熟之前，人們無法確定人乳中微生物的菌落組成，更談不上研究菌落的多樣性和穩定性。歸功于近十年來新一代測序技術的發展，人們對體內微生物群落組成的理解有了顯著進展。目前用于鑒別人乳微生物的常用方法有培養基篩查法和不依賴培養基的方法。

3.1 傳統培養基法與不依賴培養基法的比較

傳統培養基篩選法是最常用于母乳微生物分離的方法，優點是可得到分離的菌株進行鑒定和計數，還可進一步研究，但操作復雜、耗時，且該方法的檢測結果一定程度上取決于母乳樣本的新鮮程度，若存在交通不便和樣品轉運不及時，則不能使用這種方法。不依賴培養基法即分子生物學分析方法，近年來被用于母乳微生物的測定，該方法可使用冷凍保存的母乳樣本，可直接分析母乳中微生物DNA多樣性，從而獲得微生物的種類與構成。此方法操作簡單快速，但無法分離得到細菌菌株。

上述檢測母乳微生物的分析方法各有優劣，傳統的培養基篩選可分離得到相應的菌株且可對菌株作后續研究，而分子生物學的方法分析快速、簡便。因此選擇何種方法取決于研究目的。在2015年前，使用不基于培養基技術，如聚合酶鏈式反應(polymerase chain reactions，PCR)等檢測母乳菌群組成的研究相對較少，近年來PCR技術逐漸成為檢測母乳菌群的主流技術。

3.2 分子生物學分析方法的應用

宏基因組技術的成熟催生了2008年前后展開的人類宏基因組研究計劃。該計劃為微生物菌落生態學的復興奠定了堅實技術基礎。例如，在Hunt等[2]的宏基因組測序研究中，收集并分析了16例哺乳期婦女的47份乳樣，提供了較為全面的母乳細菌菌群測序數據。目前聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳(PCR-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE/TGGE)、定量即時PCR(quantitative real time- PCR，qRT-PCR)和454焦磷酸測序等分子生物學方法已被用于分析人乳微生物種類與構成。

3.2.1聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳

利用PCR-DGGE/TGGE方法，根據數據庫的比對結果可分析母乳中微生物的種屬及其亞種，Martin等[4]用PCR-DGGE分析了母乳中細菌多樣性，從4個人乳樣品中共檢出20多種細菌，如人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、唾液鏈球菌等。然而采用qRT-PCR卻只能分析出復雜樣品內某一群微生物及數量，如Martin等[32]用該方法分析了母乳中總細菌和雙歧桿菌的數量，比較了母乳和嬰兒糞便細菌組成的差異，Collado等[5]分析了母乳中細菌菌落的多樣性。而454焦磷酸測序具有高通量、快速、準確和靈敏度高等特點，已被應用于多種微生物種類的分析，如Hunt等[2]用該方法證明母乳中存在沙雷氏菌屬、羅爾斯通菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。

3.2.2定量即時聚合酶鏈式反應

由于qRT-PCR需要依賴標準曲線來定量，而且會造成較低豐度的DNA定量的不精準，Qian等[24]比較了用數字微滴式(droplet digital)PCR和qRT-PCR檢測中國人乳中的乳酸菌和雙歧桿菌，發現不需要校準曲線的數字微滴式PCR的檢出限比另一種方法提升了十多倍，且兩種技術的檢測結果有較好的相關性和一致性。

基因組學、環境基因組、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等組學方法用于人乳和乳腺中微生物的研究也在進行中，這些結果將有助于更好地了解人乳中存在的微生物種類和多樣性。這些不基于培養的、高通量分子手段的應用，使人們得以探究之前并不廣為人知的人乳微生物組學[33]。隨著組學研究的不斷深入，未來將會有更多的組學技術被用來研究人乳微生物[11]。

4 展望

在母乳喂養兒的早期免疫系統啟動和腸道成熟方面，母乳的細菌多樣性發揮了重要作用。目前的研究尚存在一定局限：人乳微生物研究多是橫斷面觀察研究，且基于16S rRNA擴增測序，在測量較低生物量的樣品(如乳樣)時，易受試劑污染的影響，且不能鑒別細菌是否存活。建議未來重點研究人乳微生物菌群組成及與喂養兒健康狀況的關系，包括：①人乳中細菌的多樣性、活性與功能的鑒定；②不同泌乳期乳汁中細菌菌群豐度和多樣性的變化及影響因素；③微生物中其他成分，如母乳中病毒或真菌及其毒素的含量以及對喂養兒健康狀況的影響；④人乳微生物組成與母親和嬰兒免疫系統交互影響的評價，以及這些微生物如何影響喂養兒的健康狀況；⑤通過系統的實驗方法和恰當的試驗模型，研究人乳微生物的功能作用；⑥特殊醫學狀況下的母乳微生物組學，及捐贈母乳對早產兒腸道菌群的影響仍待探尋。通過這些深入研究，可揭示在生命最初1 000天母親-微生物-嬰兒間的相互作用、人乳微生物群的功能以及對母嬰健康狀況的近期與遠期效應。