大腸桿菌疫苗對胎兔肺發育成熟的影響

翁增鳳，陳 麗，陳光明

(聯勤保障部隊第九○○醫院兒科 原解放軍福州總醫院，福建 福州 350025)

新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)又稱新生兒肺透明膜病，是新生兒科急癥，主要是肺表面活性物質(pulmonary surfactant，PS)缺乏及肺結構發育不成熟所引起的[1-2]。前期，筆者團隊發現宮內注射大腸桿菌(Escherichia coli，E.coil)疫苗誘導體液免疫應答后能夠促進胎兔PS中主要構成成分磷脂的蛋白表達和生成，可能對胎兔肺的發育成熟具有潛在的積極作用。本研究通過觀察大腸桿菌疫苗干預后胎兔肺結構和功能改變情況，旨在評價大腸桿菌疫苗是否能夠促進胎兔肺發育成熟。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級新西蘭大耳雌性白兔共20只，雄性白兔2只，體重(3.33±0.24)kg，購自上海市松江區松聯實驗動物場，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0011。大腸桿菌疫苗(成都天邦生物制品有限公司)。本研究通過醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 建模與分組

新西蘭大耳雌性白兔發情后與雄兔自然交配，以交配后第1天定義為妊娠第1天。妊娠期間常規飲食。將妊娠兔隨機分為兩組，每組10只；大腸桿菌疫苗組于妊娠第10天、第17天和第24天，乙醚吸入麻醉后，用陰道擴張器暴露子宮頸，將大腸桿菌疫苗溶液用1mL注射器注射到子宮頸肌肉內，用藥劑量為0.1mL·kg-1·d-1[3-4]；生理鹽水組于妊娠第10天、第17天和第24天，乙醚吸入麻醉后，用陰道擴張器暴露子宮頸，注射部位及劑量同大腸桿菌疫苗組。

1.3 標本采集和觀察指標

妊娠第27天用氯胺酮靜脈注射麻醉后剖宮產，取胎兔用于：①觀察胎兔自然存活時間；②測定胎兔肺壓力-容積(pressure-volume，P-V)曲線：胎兔氣管插管(用24G靜脈留置針去掉金屬針頭作為氣管導管)后連接帶有刻度的玻璃瓶及玻璃管，利用玻璃管內液體高度產生壓力梯度變化，先按10cm、20cm、30cm、40cm高度逐漸上升，后隨40cm、30cm、20cm、10cm、0cm回降，每級穩定15s，記錄相應壓力下的胎兔肺容積；③胎兔肺組織光鏡、電鏡觀察，肺干濕重比測量：光鏡切片HE染色，觀察肺組織病理改變；電鏡切片3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察肺超微結構改變；取左下肺尖1.0×1.0×1.0 cm大小肺組織進行干濕重比測量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組胎兔自然存活時間比較

大腸桿菌疫苗組胎兔存活時間明顯高于生理鹽水組，差異有統計學意義(t=9.53，P<0.01)，見表1。

表1 兩組胎兔存活時間比較

2.2 兩組胎兔肺P-V曲線比較

大腸桿菌組胎兔肺P-V曲線位于生理鹽水組之上，當壓力為30cmH2O、40cmH2O時大腸桿菌組肺容積顯著大于生理鹽水組(P<0.05)，見圖1。

注：“*”表示與生理鹽水組比較， P<0.05。

2.3 兩組胎肺干濕重比

兩組胎兔出生體質量和肺干重比較差異均無統計學意義(t=0.44、0.24，P>0.05)，大腸桿菌組胎兔肺濕重顯著小于生理鹽水組，胎兔肺干濕重比顯著大于生理鹽水組，差異均具有統計學意義(t=3.87、5.26，均P<0.01),見表2。

表2 兩組胎兔肺干濕重比的比較情況

2.4 兩組胎兔肺光鏡組織病理學變化

生理鹽水組光鏡下可見部分肺泡塌陷，肺泡間壁相互貼近；大腸桿菌疫苗組可見肺泡擴張，結構完整,見圖2。

注：A.大腸桿菌疫苗組；B.生理鹽水組。

2.5 兩組胎兔肺電鏡病理超微結構改變

生理鹽水組可見完整細胞核，板層體呈空泡化改變，線粒體腫脹，體積增大，細胞游離面僅有少許微絨毛，可見微絨毛脫落。大腸桿菌疫苗組可見完整細胞核，板層體較生理鹽水組多，線粒體完整，可見內質網等細胞器，細胞游離面可見微絨毛,見圖3。

注：Nu:細胞核；LB：板層體；Mi:線粒體；Er:內質網；Mv:微絨毛。A.大腸桿菌疫苗組；B.生理鹽水組。

3 討論

前期研究發現，輔助性T(helper T，Th)細胞在免疫系統中起重要作用，其中Th1細胞介導的炎癥反應參與細胞免疫應答，對胎肺發育成熟產生不利影響；而接種細菌疫苗可刺激機體產生Th2細胞介導的體液免疫應答，可能對胎肺發育成熟產生積極作用[3-4]。本課題組前期的研究發現產前接種大腸桿菌疫苗可明顯上調胎兔肺泡SP中磷脂生成和蛋白表達，但是，關于大腸桿菌疫苗宮內注射能夠促進胎兔肺結構和功能發育成熟的直接證據仍然有限。

3.1 大腸桿菌疫苗對胎兔肺組織結構發育成熟的影響

本實驗通過對孕兔宮內注射大腸桿菌疫苗和生理鹽水進行干預，以此分別模擬誘導體液免疫應答和安慰劑對照。光鏡下觀察發現生理鹽水組鏡下可見部分肺泡塌陷，肺泡間壁相互貼近；而大腸桿菌組肺泡擴張，結構完整。電鏡觀察到生理鹽水組板層體呈空泡化改變，線粒體腫脹，體積增大，細胞游離面僅有少許微絨毛，可見微絨毛脫落；而大腸桿菌組均可見完整細胞核，板層體數量較生理鹽水組多，線粒體均完整，可見內質網等細胞器，細胞游離面可見微絨毛。板層體是肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ，AEC Ⅱ)內一種呈球形、內含同心圓或平行排列的板層結構，主要由磷脂、蛋白質和糖胺多糖構成，不僅是PS的貯存部位，也是PS的分泌顆粒，并以出胞的方式分泌PS，隨著肺發育成熟，板層體數量逐漸增加，所以板層體數量側面反應胎肺的成熟情況[5]。因此，本研究結果提示產前接種大腸桿菌疫苗誘導體液免疫應答可促進胎兔AEC Ⅱ發育、改善肺超微結構，對促進胎肺結構發育成熟具有一定作用。

3.2 大腸桿菌疫苗對胎兔肺功能發育成熟的影響

NRDS患兒由于PS不足、肺泡萎陷、肺順應性下降、通氣換氣功能受損，導致肺毛細血管損傷和膜的通透性增加，大量血漿蛋白質和血管內水分漏入肺泡，出現肺水腫，嚴重者肺泡內的滲出液可形成一層“嗜依紅透明膜”，引起急性低氧血癥性呼吸衰竭[6-7]。本研究通過測繪兩組胎兔肺P-V曲線，發現隨著對胎兔肺外加壓力的遞增，大腸桿菌組胎兔肺容積明顯大于生理鹽水組，胎兔肺干濕重比明顯大于生理鹽水組。肺P-V曲線是反映肺順應性的較好指標，與肺通氣和換氣功能具有顯著相關性，肺干濕重比則能夠反映肺水腫和肺損傷的程度，肺濕重越大表示肺組織含水量越大，在一定程度上反映了肺水腫和肺損傷的嚴重程度[8]。因此，本研究結果提示產前接種大腸桿菌疫苗可減輕肺泡萎陷，有利于肺泡保持擴張狀態，從而能更好地保持功能殘氣量，有利于維護肺的氣體交換功能。

綜上所述，產前接種大腸桿菌疫苗誘導體液免疫應答可促進胎兔肺AEC Ⅱ發育、改善肺超微結構、促進胎兔肺發育，進而防止肺泡萎陷，促進肺泡擴張，增加肺容積，改善通氣和換氣功能，減輕肺泡內滲出，減輕肺水腫，最終延長胎兔的存活時間。提示產前接種大腸桿菌可能有利于減輕或防止NRDS發生，這也為預防早產兒NRDS的發生提供了新的思路。但關于炎癥狀態下改善胎肺AEC Ⅱ超微結構機制尚不明確，今后仍需大量研究去證實，為炎癥誘導肺發育的安全性提供更多的實驗依據。