木棉花提取物對酪氨酸酶抑制作用的研究*

包文龍，馮俊華，勞成景，譚蓓蓓

(廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530007)

木棉花(kapok), 別稱英雄花、烽火 , 為我國南方特產(chǎn)木棉科木棉屬植物木棉的花朵,主要分布在廣東、廣西、四川、云南等地區(qū)。其藥性甘、淡，涼，具有清熱解毒，涼血之功效[1]。民間常將其晾干后泡水服用或煲湯食用。廣東等地生產(chǎn)的五花茶涼茶，由木棉花與金銀花、菊花、雞蛋花、槐花配制而成，深受消費者喜愛。木棉的花大而美，樹姿巍峨,極具觀賞價值，成為南寧市道路和園庭綠化環(huán)境的優(yōu)良觀賞樹種。但是每年大量落花被作為廢棄物處理實則可惜。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對木棉花化學(xué)成分和藥理活性進(jìn)行了大量研究，研究表明木棉花所含成分主要包括有多糖、黃酮類、苯丙素類及甾醇、脂肪酸和紅色素等活性物質(zhì)[2-4]。藥理研究表明其生物活性主要有抗氧化[5]、抗炎[6]、抗菌[7]及保肝[8]和抗腫瘤[9]等。本實驗通過木棉花不同部位提取物對酪氨酸酶活性抑制作用的研究探索木棉花的新功效，為木棉花落花資源的充分利用，作為天然藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料、試劑和儀器

木棉花，三月于廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)采摘；新鮮馬鈴薯，購自南寧市利客隆超市。

L-酪氨酸，Sigma公司；熊果苷，上海圻明生物科技有限公司；75%乙醇；二甲基亞砜(DMSO)；磷酸；磷酸氫二鈉；濃鹽酸；均為市售分析純；D101大孔樹脂，天津市海光化工有限公司。

T500型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；EL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；TM-767(Ⅲ)攪拌機(jī)，中山市海盤電器有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TD-600臺式低速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；DHG-9203A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)有限公司；VIS-7220N可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 木棉花的摘取及干燥

三月份在廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)摘取，整朵放入電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥，得整朵干燥木棉花。分出花托、花瓣、雄蕊、帶雄蕊花托等材料。

1.2.1.2 木棉花醇提物的制備

分別稱取干燥木棉花花托、花瓣、雄蕊和干燥木棉花帶雄蕊花托各 10.00 g，使用75%乙醇至電熱恒溫水浴鍋上恒溫回流提取1.5 h/次。共回流提取3次，合并三次提取液后進(jìn)行真空抽濾，減壓濃縮后真空干燥，得木棉花四部位醇提物。

1.2.1.3 木棉花水提物的制備

分別稱取干燥木棉花花托、花瓣、雄蕊和干燥木棉花帶雄蕊花托各 10.00 g，使用蒸餾水至電熱恒溫水浴鍋上恒溫回流提取1.5 h/次。共回流提取3次，合并三次提取液后進(jìn)行真空抽濾，減壓濃縮后真空干燥，得木棉花四部位水提物。

1.2.1.4 木棉花總黃酮的制備

稱取干燥木棉花雄蕊10.00 g， 加適量石油醚加熱回流脫脂1.5 h/次，將三次浸提液過濾棄掉，濾渣揮干殘余石油醚后加入 75%乙醇至電熱恒溫水浴鍋上恒溫回流提取1.5 h/次，共回流提取3次，合并三次乙醇提取液后進(jìn)行真空抽濾，所得濾液平分成兩部分，一部分進(jìn)行減壓濃縮后真空干燥，即得干燥木棉花雄蕊總黃酮提取物；另一部分減壓濃縮至料液比為1∶2后，分別使用30%和60%乙醇通過HPD-101大孔樹脂進(jìn)行洗脫分離。所得兩部分洗脫液分別進(jìn)行減壓濃縮后真空干燥，既得木棉花30%乙醇濃度洗脫流份和60%乙醇濃度洗脫流份。

1.2.2 酪氨酸酶原液的制備

將去皮切碎經(jīng)過預(yù)冷的馬鈴薯與預(yù)冷的磷酸鈉緩沖液，按照固液比 1∶1 (w∶v)的比例，加入攪拌機(jī)制成勻漿，用四層紗布過濾，收集濾液于離心機(jī)離心(4000 r/min)10 min，取上清液，即得酪氨酸酶原液，于-10 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 試劑配制

1.2.3.1 磷酸鈉緩沖液

精確稱取磷酸氫二鈉1.0000 g，磷酸二氫鈉1.0000 g，加入少量去離子水溶解后，定容于 500 mL容量瓶，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.3.2 L-酪氨酸溶液

精確稱取0.3400 g L-酪氨酸，于250 mL容量瓶中，先加入3～4滴濃鹽酸，加適量去離子水，水浴微熱使其完全溶解后，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)L-酪氨酸溶液pH至7.0，加去離子水定容至 250 mL。

1.2.3.3 受試液

精確稱取木棉花各部位水提物、醇提物及黃酮提取物各項各0.2000 g，分別溶于25 mL二甲基亞砜溶液中，即得到初始濃度為8.00 mg/mL的待測液，再分別稀釋至4.00、2.00、1.00和0.50 mg/mL四個待測濃度。

1.2.3.4 陽性對照液

精確稱取熊果苷粉末0.2000 g，溶于25 mL的去離子水中，即得到初始濃度8.00 mg/mL 的陽性對照母液，再稀釋至4.00、2.00、1.00和0.50 mg/mL四個待測濃度。

1.2.4 樣品對酪氨酸酶活性的抑制

用移液管按表1的體積向試管依次加入磷酸鹽緩沖液、不同濃度梯度的木棉花提取物受試液、不同濃度梯度的熊果苷對照液和酪氨酸酶液，置于37 ℃水浴預(yù)混合10 min后，加入底物L(fēng)-Tyr，反應(yīng)15 min，迅速移入比色皿，測定在475 nm波長下的吸光值。每個濃度實驗做3個平行，按照以下公式計算木棉花提取物對酪氨酸酶的抑制率：

抑制率=[1-(B1-B2)/(A1-A2)]×100%

式中：A1為有酶無樣品時的吸光度，A2為無酶無樣品時的吸光度，B1為有酶有樣品時的吸光度，B2為無酶有樣品時的吸光度，C1為陽性對照品加酶時的吸光度，C2為陽性對照品無酶時的吸光度。

表1 反應(yīng)液組成與體積

實驗數(shù)據(jù)用EXCEL統(tǒng)計，組間對照進(jìn)行T檢驗，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 木棉花醇提物對酪氨酸酶活性的影響

以L-酪氨酸為底物，考察木棉花花托帶雄蕊醇提物、雄蕊醇提物、花托醇提物、花瓣醇提物及熊果苷對酪氨酸酶活性抑制作用，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出各項樣品對L-酪氨酸的酶促氧化進(jìn)程均表現(xiàn)出抑制作用，且隨著各受試液質(zhì)量濃度的增加，抑制率也呈穩(wěn)態(tài)增加趨勢，表現(xiàn)為濃度依賴性抑制。其中以雄蕊醇提物和花托醇提物對酪氨酸酶的抑制作用最為明顯，且抑制率高于同濃度的陽性對照組熊果苷的抑制作用(P<0.01)；而總醇提物在0.05 mg/mL時抑制作用優(yōu)于熊果苷(P<0.05)其他濃度抑制率與熊果苷相當(dāng)；花瓣醇提物各濃度抑制率遠(yuǎn)低于熊果苷(P<0.05)。在實驗濃度范圍內(nèi)，木棉花醇提物對酪氨酸酶的抑制率高達(dá)78%。

圖1 木棉花各部位醇提物和熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用

2.2 木棉花水提物對酪氨酸酶活性的影響

圖2 木棉花各部位水提物和熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用

以L-酪氨酸為底物，考察木棉花花托帶雄蕊水提物、雄蕊水提物、花托水提物、花瓣水提物及熊果苷對酪氨酸酶活性抑制作用，結(jié)果如圖2所示。在實驗濃度范圍內(nèi)，木棉花不同部位提取物對L-酪氨酸的酶促氧化進(jìn)程表現(xiàn)出較弱的抑制作用在20%以下，除花托和花瓣水提物在0.05 mg/mL濃度時與陽性對照熊果苷的抑制率活性相當(dāng)外，其余部位均明顯低于熊果苷(P<0.01)。由此可見，木棉花的水提物中對酪氨酸酶起抑制作用的有效成分較少。

2.3 木棉花雄蕊總黃酮、30%流份、60%流份對酪氨酸酶活性的影響

以L-酪氨酸為底物，考察木棉花雄蕊提物總黃酮，及兩種流份對酪氨酸酶活性抑制作用的，結(jié)果如圖3所示。在實驗濃度范圍內(nèi)，木棉花黃酮提取物對L-酪氨酸的酶促氧化進(jìn)程均表現(xiàn)出明顯抑制作用，均高于對照品熊果苷的抑制作用(P<0.01)。且隨著濃度的增加，抑制率呈上升趨勢，表現(xiàn)為濃度依賴性抑制作用，而60%流份在濃度達(dá)到0.20 mg/mL后，上升趨勢緩慢且趨于平衡狀態(tài)。其中雄蕊總黃酮的抑制率高達(dá)91%。

圖3 木棉花雄蕊黃酮提取物和熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用

由圖1和圖2可以看出，同種提取溶劑花托提取物對酪氨酸酶的抑制率高于其他部位提取物的抑制率。這是由于木棉花的主要抗氧化活性物質(zhì)為黃酮類成分和酚酸類成分[10]，而花托的化合物種類和含量都高于花蕊和花瓣[11]。圖3結(jié)果顯示在濃度達(dá)到0.2 mg/mL后，30%流份的抑制率扔在顯著上升且高于60%流份的抑制率，由于木棉花抗氧化活性成分復(fù)雜多樣，在使用不同濃度的乙醇洗脫后，兩流份的化合物成分及含量存在差異，因此存在對酪氨酸酶的抑制率差異，其成分和含量有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是一種氧化還原酶，廣泛存在于植物、動物和人體中，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶。在人體中，主要存在于皮膚表皮細(xì)胞的黑色素細(xì)胞中[11]。黑素的生物合成是由酪氨酸酶催化體內(nèi)L-酪氨酸(L-Tyr)生成多巴，多巴進(jìn)一步氧化成多巴醌 ,多巴醌再經(jīng)一系列化學(xué)變化 ,最后產(chǎn)生黑色素的過程[12]。研究表明酪氨酸酶的活性與黑素合成量相關(guān)，控制其活力即可控制黑素生成量[13]。因此，研究天然提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用，對開發(fā)抑制黑色素生成進(jìn)而達(dá)到美白皮膚效果的天然植物化妝品具有重要的意義。

本實驗以目前美白化妝品中應(yīng)用最廣泛的熊果苷作為陽性對照品，使實驗更具參照性。本文研究得出以下結(jié)論：

(1)木棉花提取物對酪氨酸酶活性抑制作用以醇提物為主，表明主要活性成分存在于乙醇提取物中。

(2)木棉花提取物不僅對酪氨酸酶活性具有抑制作用，并且對酪氨酸酶活性的抑制效率呈劑量依賴性關(guān)系。

(3)同一提取溶劑木棉花花托部位的提取物對酪氨酸酶活性的抑制率均高于雄蕊、花瓣的提取物，在實驗濃度中花托醇提物的抑制率高達(dá)78%，且優(yōu)于陽性對照熊果苷的抑制率(P<0.05)。

(4)木棉花雄蕊總黃酮提取物對酪氨酸酶的抑制作用最為顯著，各實驗濃度均高于同濃度的陽性對照組熊果苷的抑制作用(P<0.01)，且實驗濃度范圍最高抑制率可達(dá)91%。

(5)在使用30%乙醇和60%乙醇兩種不同濃度洗脫液進(jìn)行總黃酮流份制備，所得30%流份對酪氨酸酶活性的抑制率高于60%流份的抑制效果，通過查閱資料得出此結(jié)果可能是由于木棉花的抗氧化活性成分復(fù)雜多樣有關(guān)，此結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

(6)當(dāng)前化妝品中所用的美白成分，絕大部分以酪氨酸酶抑制劑為主，木棉花來源廣泛，其在民間和涼茶應(yīng)用極為廣泛，是藥食兩儀的植物，且廉價易得，是一種極具市場開發(fā)潛力的天然酪氨酸酶抑制劑。