東北平榛葉中一株鏈格孢屬內生真菌的分離鑒定

周永強 趙春麗* 薛 娟 丁晶鑫

（貴州中醫藥大學 藥學院，貴州 貴陽550025）

植物內生植物是一種能產生多種生物成分的新型微生物資源，具有重要的研究價值和廣闊的開發前景。從一些藥用植物中分離某些內生菌，利用內生真菌發酵能生產具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒的天然活性物質來代替藥用植物，可為新藥物的開發利用提供了新的途徑，具有極大的應用價值和開發潛力[1]。

榛樹有平榛，毛榛，刺榛等12 個品種，我國的種植歷史悠久，資源廣泛，其中種植的最為廣泛的是平榛，在我國黑龍江、吉林、山西、河北等地均有大量種植。榛子樹葉中含有的鞣質、紫杉醇等化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降低血糖、降血脂等生物活性。從植物中分離出來的真菌有極大的可能性產生與宿主相同或相似的化學成分，有較好的利用價值，或將篩選出能產生有效成分的菌種，經過育種和基因組的改造等方式，可以得到繁殖周期短，繁殖系數大，有效產量高，更便于組織工業化的生產的菌種。因此從植物中分離出內生真菌再加以篩選改造，以擴大藥物的來源和發現新的有效成分，是一件值得探索的工作。

本研究對平榛的內生真菌進行分離并鑒定其種屬，對平榛內生真菌的種類，其代謝產物的生理活性具有一定的參考意義。

1 材料

1.1 供試菌株

內生真菌菌株ZL-6 是從平葉榛葉中分離得到，保存在在貴州中醫藥大學藥學院生物制藥實驗室。

1.2 主要試劑

Tris Amino、dNTP Mix、DNA Marker、10×Taq Buffer、Taq DNA 聚合酶、GeneRed 核酸染料購于南京諾維贊生物科技有限公司；引物V9D 和引物LS266 均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 主要儀器

光照培養箱（GZX-400EF）、超凈工作臺（CJ-2S）購自天津泰斯特儀器有限公司；滅菌鍋（LDZM-40L）購自上海申安醫療器械廠；振蕩培養箱（BS-1EA）購自常州市華普達儀器有限公司；凝膠成像分析系統（Gel Doc XR+）購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 內生真菌ZL-6 的形態學鑒定

圖1 內生真菌ZL-6 的形態特征

圖2 菌ZL-6 的ITS 系統進化樹

將內生真菌ZL-6 在超凈工作臺上接種到PDA 培養基平板上，置于28℃恒溫培養箱中培養。待菌落長滿后觀察培養基中菌落的形態、大小、顏色及生長情況。蓋玻片滅菌后傾斜45°角插入PDA 培養基內，挑取ZL-6 內生真菌菌絲種于插有滅菌過的蓋玻片與PDA 培養基的交叉線處，培養3-5d，待蓋玻片上的菌絲貼附后，撥出，經乳酸- 棉蘭染液染色，在光學顯微鏡下觀察真菌結構，對照《真菌鑒定手冊》進行形態學鑒定[2]。

2.2 內生真菌ZL-6 的分子鑒定

將于搖床發酵4d 的內生真菌ZL-6 的發酵液抽濾得到菌絲體，內生真菌基因組DNA 使用液氮研磨法提取。內生真菌基因組DNA 提取后，采用引物V9D 和LS266 對內生真菌進行ITS序列擴增，并將PCR 擴增片段進行測序。將已經測得的序列結果與GenBank 中已知序列進行比較分析，再從Genbank 數據庫中獲取相關菌的種屬的ITS 序列信息，應用MEGA5.05 軟件進行多序列比對，構件系統進化樹[3]。

3 結果與分析

3.1 平葉榛內生真菌ZL-6 的形態學

菌株ZL-6 在PDA 平板生長7 d 時，單菌落表面不平，菌落中心色澤為褐色，菌落邊緣帶白色。菌落質地絮狀，菌落較厚，平坦，呈圓形生長，部分有滲出液。主要顯微形態特征菌絲彎曲鏈狀，有少量暗色的梨型分生孢子，既有橫隔又有縱隔。根據菌株ZL-6 的形態學特征將其鑒定為Alternaria alternata（鏈格孢屬）（圖1）。

3.2 平葉榛內生真菌ZL-6 分子鑒定

內生真菌ZL-6 的DNA 模板經ITS 區經引物V9D 和LS266 擴增、PCR 產物測序得到1009bp 的rDNA 序列。

將所測內生真菌ZL-6 的擴增產物序列輸入NCBI 中進行Blast 序列比對分析，篩選出與內生真菌ZL-6 種屬最相似的序列，并用MEGA5.05 軟件構建系統進化樹，結果顯示，在進化樹中，內生真菌ZL-6 與Alternaria alternata GU797138 聚類在同一分支（圖2），親緣關系最為接近，結合在GenBank 中登錄結果顯示二者相似度為100%，同時，結合ZL-6 的形態學特征，最終將菌株ZL-6 鑒定為Alternaria alternata（鏈格孢屬）。

4 結論

本研究首次從平葉榛的葉中分離得到內生真菌ZL-6，并采用形態學及分子鑒定方法將其鑒定為Alternaria alternata（鏈格孢屬）。研究結果將為榛樹內生真菌的分離及鑒定提供了參考。