綠海龜源溶藻弧菌的分離鑒定及藥敏分析

葉明彬，陳華靈，馮國清，梁志凌，端金霞，劉振興，觀玉安

（1.廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，廣東 惠東 516359；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】近年我國年上岸產(chǎn)卵綠海龜數(shù)量急劇下降，《中國海龜保護(hù)行動計劃（2019—2033年）》鼓勵通過海龜全人工繁育，探索野外種群補(bǔ)充新途徑，以加快野生海龜資源恢復(fù)［1］。但人工條件下親龜活動空間受限，環(huán)境和食物的改變也會對子代的生長發(fā)育產(chǎn)生較大影響；水質(zhì)變壞、體表外傷等容易導(dǎo)致龜苗染病，甚至大量死亡。目前，海龜疾病診斷和治療困難，給人工繁育尤其龜苗規(guī)模化培育帶來極大困擾［2］。弧菌是海水中的常見細(xì)菌，廣泛存在于海洋環(huán)境和海洋生物的體表和腸道中，且能造成較為嚴(yán)重的細(xì)菌疾病［3］，對大多數(shù)海水養(yǎng)殖對象包括魚、蝦、蟹和貝殼類等，均有不同程度危害。體表潰瘍、出血，鰓絲腐爛等是弧菌病的主要癥狀［4］。開展海龜弧菌病的流行病調(diào)查及弧菌的耐藥試驗(yàn)，對海龜?shù)牟『Ψ揽鼐哂兄匾饬x。【前人研究進(jìn)展】在人工養(yǎng)殖條件下，餌料和環(huán)境變差可導(dǎo)致海龜體質(zhì)下降，易感染寄生類、消化呼吸類及營養(yǎng)類疾病。海龜常見疾病多由細(xì)菌、真菌和病毒感染引起，一般表現(xiàn)為肛門腫大、四肢及腹甲發(fā)炎或體表多處皮膚、甲殼糜爛等。海龜腐甲病是環(huán)境惡化引起的一種常見的細(xì)菌、真菌混合感染疾病，若不加以控制，海龜會出現(xiàn)停食、精神萎靡和大面積糜爛，直至死亡［5］。澳大利亞昆士蘭州2006—2009年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，綠海龜常發(fā)寄生性疾病（41.8%）、胃腸道疾病（11.8%）、微生物感染疾病（5.2%）和體表創(chuàng)傷（5.2%），其他疾病患病率較低［6］。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于綠海龜?shù)谋Ｗo(hù)生物學(xué)、生態(tài)研究、人工飼養(yǎng)及組織病理學(xué)均有較多報道，病害分類和機(jī)理研究方面也有相關(guān)報道，但都比較籠統(tǒng)。國內(nèi)已有假單胞菌屬細(xì)菌（Pseudomonas medocina、Pseudomonas viridilivida）導(dǎo)致海龜腐皮病的報道［7］，綠海龜弧菌病傳染性強(qiáng)、死亡率高，但有關(guān)弧菌感染綠海龜致病的案例鮮有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】溶藻弧菌是一種嗜鹽性弧菌，可引發(fā)人體中耳炎、傷口感染、腸炎等，也可感染多種水生動物，如斜帶石斑魚、凡納濱對蝦、大黃魚、半滑舌鰨和紫貽貝等，引起大量死亡［8］。本研究于2019年10月在綠海龜稚龜鰭狀肢腐皮病灶上分離純化得到1株優(yōu)勢菌，對該菌株進(jìn)行生理生化鑒定，16SrRNA序列和系統(tǒng)發(fā)育樹初步分析，證實(shí)該菌株為溶藻弧菌。此外，對該菌進(jìn)行藥物敏感性測定，為防控綠海龜感染溶藻弧菌提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海龜病料于2019年10月采自廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)，為人工繁育過程中死亡綠海龜稚龜?shù)啮挔钪Ｔ擌挔钪吘壩恢贸霈F(xiàn)明顯的表皮腐爛，組織壞死變黃并深入到骨骼處。

供試血平板、TCBS培養(yǎng)基及生化鑒定管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2×TaqMaster Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞及T載體pEASY-T1 Simple Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；16SrRNA的PCR擴(kuò)增通用引物27F/1492R［9］及熱休克蛋白基因（Heat shock protein 60 gene，hsp60）簡并引物［10］（表 1），由擎科生物科技有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化與形態(tài)觀察 綠海龜稚龜?shù)啮挔钪×嫌忻黠@腐皮癥狀（圖1），用75%酒精擦拭表面，用無菌解剖剪在腐皮病灶上剪開缺口，將無菌接種環(huán)探入腐皮中，劃線于血平板上，于30℃下培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，同時劃線于TCBS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察菌株是否生長。另挑取單菌落用LB液體培養(yǎng)基于30℃下過夜擴(kuò)培。

表1 PCR擴(kuò)增引物信息Table 1 Primers for PCR amplification

圖1 綠海龜鰭狀肢腐皮癥狀Fig. 1 Symptoms of decayed skin of flippers in green sea turtle

1.2.2 菌株的生理生化特征鑒定 挑取純化后的單菌落置于0.85%生理鹽水中，將菌懸液制備成與0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管相同的濃度（約1.5×108CFU/mL），按照使用說明接種到細(xì)菌生化鑒定管中，37℃下培養(yǎng)24 h。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］對分離菌株的生理生化結(jié)果進(jìn)行鑒定。

1.2.3 菌株16SrRNA及hsp60基因序列鑒定 取擴(kuò)培后的菌液，按照天根細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌體DNA作為PCR模板。16SrRNA基因PCR擴(kuò)增體系為 50 μL：2×TaqMaster Mix 25 μL，引 物 27F（10 μmol/L） 和 1492R（10 μmol/L）各 2 μL，模板 2 μL，補(bǔ)充 ddH2O 至 50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，剩余PCR產(chǎn)物送至廣州擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對。使用Mega7.0對序列進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

hsp60基因的PCR 擴(kuò)增體系為20 μL：2×TaqMaster Mix 10 μL，引物 hsp60F（10 μmol/L）和hsp60R（10 μmol/L）各 1 μL，模板 1 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行切膠回收，使用pEASY-T1 Simple Cloning Kit進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布氨芐抗性LB平板，挑選陽性克隆搖菌后送至廣州擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對。

1.2.4 菌株藥敏試驗(yàn) 參照曾德乾等［11］方法，用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法），以大腸桿菌ATCC25922為參考菌株，檢測分離菌對 27種藥物的敏感性。取200 μL 0.5麥?zhǔn)蠞岫龋s1.5×108CFU/mL）的菌懸液涂布于含0.1%NaCl的MH瓊脂平板，每個平板均勻貼上6個藥敏紙片，于30℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，測量并記錄抑菌圈直徑，依據(jù) WS/T125-1999［12］判斷分離菌株的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離純化與形態(tài)觀察

分離菌株在血平板生長，菌落為乳白色，扁平，有光澤，有粘性且邊緣皺褶（圖2）；分離菌株也能在TCBS培養(yǎng)基上生長，菌落為黃色圓形，稍隆起，有光澤，有粘性且邊緣光滑（圖3）。經(jīng)革蘭氏染色，菌株為革蘭氏陰性短桿菌（圖4），命名為CMRT91026。

圖2 血平板上的菌落形態(tài)Fig. 2 Morphology of strains on blood agar

圖3 TCBS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig. 3 Morphology of strains on TCBS medium

圖4 分離菌株革蘭氏染色Fig. 4 Gram stain of isolated strains

2.2 菌株的生理生化特征鑒定

結(jié)果（表2）顯示，菌株CMRT91026的VP反應(yīng)，蔗糖、甘露糖、賴氨酸脫羧酶檢測呈陽性；該菌不能在無鹽胨水中生長，在3%、6%、8%和10%的NaCl胨水中均能生長；葡萄糖產(chǎn)氣，蛋白胨水、阿拉伯糖、肌醇和精氨酸雙水解酶均呈陰性。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］，菌株CMRT91026與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33787的生理生化特征鑒定結(jié)果一致，初步鑒定為溶藻弧菌。

2.3 菌株的16SrRNA及hsp60基因序列鑒定

菌株CMRT91026的16SrRNA及hsp60基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖5。將菌株CMRT91026的16SrRNA測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示該菌與GenBank 登錄號為MT549165.1的溶藻弧菌同源性為100%。使用MEGA7.0軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），CMRT91026與溶藻弧菌NR_113781、NR_117895.1聚為一支。hsp60基因擴(kuò)增片段經(jīng)連接載體測序，NCBI序列比對結(jié)果顯示該序列與溶藻弧菌（GenBank登錄號為AF230931.1）hsp60的基因序列同源性為99.28%，進(jìn)一步確定分離菌株為溶藻弧菌。

2.4 菌株藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，CMRT91026菌株對新霉素、多西環(huán)素、阿莫西林、利福平、頭孢拉定、頭孢呋辛、鏈霉素、麥迪霉素、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、苯唑西林、紅霉素、阿奇霉素和四環(huán)素等15種藥物耐藥；對氟苯尼考、復(fù)方新諾明、妥布霉素、大觀霉素、諾氟沙星和氨曲南等6種藥物中介；對恩諾沙星、萘啶酸、米諾環(huán)素、左氧氟沙星、頭孢吡肟和頭孢曲松等6種藥物敏感。

表2 菌株CMRT91026生理生化特征鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain CMRT91026

圖5 菌株CMRT91026 16SrRNA和hsp60基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 PCR amplification of 16SrRNA and hsp60 gene from strain CMRT91026

圖6 基于16SrRNA基因構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree based on 16SrRNA gene sequence

3 討論

溶藻弧菌是海洋中一種常見的弧菌，有關(guān)資料顯示，海水和海產(chǎn)品中的溶藻弧菌帶菌率分別為28%和13.2%；淡水產(chǎn)品中魚、蟹、貝類和蝦等同樣存在溶藻弧菌污染，污染率不具有種的特異性［14］；廣州地區(qū)海產(chǎn)品、淡水產(chǎn)品及外環(huán)境水體中溶藻弧菌污染嚴(yán)重, 檢出率為 20.31%，其中海產(chǎn)品的檢出率高達(dá)26.30%，淡水產(chǎn)品檢出率為 11.67%［15］。目前，國內(nèi)外有較多關(guān)于溶藻弧菌感染水生動物致病的現(xiàn)象，Sangster等［16］對烏賊種群死亡原因進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，53個病例中有33個病例的溶藻弧菌呈陽性，表明該菌可引起繼發(fā)潰瘍感染，特別是受傷個體；溶藻弧菌作為潛在的細(xì)菌性病原體也可感染羅氏沼蝦導(dǎo)致死亡［17-18］；韓風(fēng)杰等［19］在山東某魁蚶養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病魁蚶和養(yǎng)殖水體中分離到的溶藻弧菌通過回歸可使健康魁蚶發(fā)病，死亡率達(dá)100%。近年來也有相關(guān)報道證實(shí)溶藻弧菌可感染人引起食物源疾病，引發(fā)呼吸道感染、血液感染、腸胃炎、傷口感染、嘔吐、腹痛和腹瀉等多種癥狀［20-22］。溶藻弧菌可感染并致病的范圍在逐步擴(kuò)大，因此對其引起的污染及病害必須予以重視。

表3 菌株CMRT91026藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Antibiotic Drug of strain CMRT91026

由于產(chǎn)卵場、海藻（草）床、珊瑚礁等重要棲息地喪失，外加人為捕殺、漁業(yè)捕撈、非法貿(mào)易、海洋污染以及餌料食物資源下降等因素，全球范圍內(nèi)的海龜都面臨極大的生存威脅［23-24］。在海龜資源的保護(hù)策略上，一方面，需要制定相關(guān)法律法規(guī)和技術(shù)規(guī)范，如加強(qiáng)洄游通道和關(guān)鍵棲息地保護(hù)，制訂人工繁育及救護(hù)技術(shù)規(guī)范等；另一方面，要加強(qiáng)海龜病害防控。目前國內(nèi)關(guān)于海龜感染弧菌致病的報道尚空白，雖然海龜生存及抗病能力都很強(qiáng)，但由于環(huán)境惡化，病害問題日益嚴(yán)重。本研究采用最基本的流行病學(xué)調(diào)查方法，分離純化海龜腐皮病的疑似病原菌，并對分離菌株進(jìn)行生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，得到了較為準(zhǔn)確的結(jié)果，同時也開展了相關(guān)的藥敏試驗(yàn)，得到該菌敏感的藥物，可用于指導(dǎo)臨床防治。但本研究未對分離菌株進(jìn)行人工回歸感染試驗(yàn)，以進(jìn)一步確定分離菌是否為真正病原菌及其致病能力強(qiáng)弱。主要是因?yàn)榭紤]到綠海龜是國際瀕危和珍稀資源，科研中也應(yīng)得到充分保護(hù)；其次可用中華草龜?shù)三旝M目物種進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)，但個體及生存環(huán)境差異較大，可能會導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果誤差較大，目前關(guān)于將龜鱉目中物種作為攻毒模型進(jìn)行試驗(yàn)的研究鮮有報道，缺少有力依據(jù)。另外，劉曉斐等［25］建立溶藻弧菌動物感染模型中采用小鼠，通過半數(shù)致死量研究感染量和感染時間，并對分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。在后續(xù)探討中我們將嘗試使用中華草龜或小鼠等動物感染模型進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，這對于探討溶藻弧菌的致病機(jī)制及其防治都具有重要意義。

采用通用引物測序16SrRNA序列，我們發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行NCBI的BLAST比對時，幾乎所有同源性高的菌株均屬于弧菌屬（Vibrio），且同源性均達(dá)到99%～100%。由于弧菌種間16SrRNA序列相似度極高，我們無法僅靠16SrRNA序列比對就將這些菌株鑒定到種的水平。16SrRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析也顯示，大多數(shù)菌株與弧菌模式種無法歸為一簇，因此16SrRNA基因在弧菌種的分類鑒定上分辨率并不高。Pascual等［26］研究表明，弧菌屬的16SrRNA序列在種內(nèi)與種間遺傳距離上具有非常大的重疊，無法提供種的水平區(qū)分能力。龔婷等［27］進(jìn)一步采用基于4種看家基因（rpoA、pyrH、gapA和topA）的多位點(diǎn)序列分析技術(shù)（MLSA）對分離到的弧菌菌株進(jìn)行分類鑒定，4種看家基因串聯(lián)后的多態(tài)位點(diǎn)比率高達(dá)41.1%，遠(yuǎn)高于16SrRNA基因的13.4%。在本研究中我們只分析了分離菌株的16SrRNA序列和hsp60基因序列，顯然還有一定不足，但結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)菌株和試驗(yàn)菌株的生化鑒定，能較為準(zhǔn)確地確定菌株CMRT91026為溶藻弧菌。

當(dāng)前細(xì)菌疾病的治療仍以抗生素為主，抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷提高。對臨床分離的病原菌進(jìn)行類別鑒定以及藥物敏感性試驗(yàn)，可根據(jù)病原菌特點(diǎn)進(jìn)行有效藥物的篩查與確定，促進(jìn)抗生素的合理使用并提高治療效果，因此臨床藥敏試驗(yàn)有重要指導(dǎo)意義。從27種抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看，本次分離的溶藻弧菌CMRT91026僅對喹諾酮類藥物的恩諾沙星、萘啶酸和左氧氟沙星3種藥物敏感，對四環(huán)素類藥物米諾環(huán)素敏感，對三代頭孢類藥物的頭孢吡肟和頭孢曲松敏感。冼鈺茵等［28］對廣州市售水產(chǎn)品分離的118株溶藻弧菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)分析，結(jié)果顯示四環(huán)素耐藥率為0、環(huán)丙沙星及慶大霉素耐藥率均為2.54%，與菌株CMRT91026藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致；此外，鄭晨暉［29］分離到的黃姑魚源溶藻弧菌對氟苯尼考和諾氟沙星敏感，與菌株CMRT91026藥敏結(jié)果也不一致。由此可以推斷，菌株CMRT91026出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。不同物種、不同環(huán)境及不同區(qū)域，即使感染的是同一種細(xì)菌，但細(xì)菌對于同種抗生素也會呈現(xiàn)出不同的敏感和耐藥情況。癥狀相同也可能由不同細(xì)菌引起或者交叉感染，如果憑經(jīng)驗(yàn)用藥往往適得其反。本研究采用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株25922一同進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，且質(zhì)控菌抑菌圈在質(zhì)控范圍內(nèi)，藥敏結(jié)果更加可靠。對于敏感藥物是否在治療海龜腐皮病有明顯效果，則需要進(jìn)一步試驗(yàn)觀察。

4 結(jié)論

本研究在患病綠海龜稚龜鰭狀肢腐皮病灶中發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌株CMRT91026，該菌株能在TCBS平板上生長，菌株的VP、賴氨酸脫羧酶和10%NaCl胨水呈陽性，與溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33787結(jié)果一致。經(jīng)16SrRNA序列分析，分離菌株與GenBank 登錄號為 MT549165.1的溶藻弧菌同源性為100%，系統(tǒng)發(fā)育樹上與溶藻弧菌聚為一簇；該菌株的hsp60基因序列與GenBank登錄號為AF230931.1的溶藻弧菌的hsp60基因序列同源性為99.28%，進(jìn)一步證實(shí)分離菌株CMRT91026為溶藻弧菌，這是國內(nèi)海龜感染溶藻弧菌的首次報道。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，本次分離菌株CMRT91026具有多重耐藥現(xiàn)象，對多新霉素、多西環(huán)素、頭孢拉定、麥迪霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星和四環(huán)素等15種藥物耐藥；對恩諾沙星、頭孢曲松和米諾環(huán)素等6種藥物敏感。因此，在選擇治療藥物時，應(yīng)該選擇更有針對性、更有效且低殘留的抗生素。此外，可選擇中草藥輔助治療，中草藥對水產(chǎn)動物疾病防治起良好作用，復(fù)方中草藥與中西藥聯(lián)用防治具有較大的應(yīng)用優(yōu)勢［30］。當(dāng)前環(huán)境下，研究與開發(fā)中草藥治療綠海龜?shù)人鷦游锛膊【哂袕V闊前景。在規(guī)模化生產(chǎn)中，可探討通過循環(huán)水系統(tǒng)開展龜苗培育，嚴(yán)格水質(zhì)凈化、投喂優(yōu)質(zhì)配合飼料及生境營造等技術(shù)規(guī)程，科學(xué)確定養(yǎng)殖密度、減少龜苗打斗受傷，增強(qiáng)免疫能力，做到預(yù)防為主、防控結(jié)合，提高育苗成活率。本研究在后續(xù)工作中需收集更多綠海龜感染致病性弧菌的案例，充分展開對海龜溶藻弧菌病原學(xué)特征和流行病學(xué)調(diào)查，進(jìn)一步探討回歸感染試驗(yàn)及感染模型選擇，分析溶藻弧菌對海龜?shù)亩玖?qiáng)弱和致病機(jī)制。