茄子褐紋病菌的分離鑒定及產孢條件的優化

衡 周，孫小晴,2，黃俊霖，孫保娟，李植良，李 穎，李 濤

（1.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.華中農業大學園藝林學學院，湖北 武漢 430070）

【研究意義】茄褐紋擬莖點霉（Phomopsis vexansHarter）是真菌界半知菌類腔孢綱球殼孢目球殼孢科擬莖點霉屬真菌，是造成茄子褐紋病的病原菌［1］。此病菌可造成茄子苗期猝倒，生長期葉片病斑、干枝、結果期果腐等癥狀，最終導致減產20%～70%［2-3］。目前針對茄子褐紋病的研究主要集中在菌株分離培養、形態學及分子鑒定、基于離體接種的致病力鑒定等方面［2,4-12］。針對褐紋病菌致病分子機理的研究還十分有限。孢子萌發是致病菌侵染植株和完成生活史的關鍵步驟［13］。通過現代組學技術對孢子萌發過程中分子水平的變化進行研究有助于找到致病菌孢子萌發過程中的關鍵基因、蛋白，也有助于定位潛在抗菌劑靶點及致病菌效應因子［14］。因此，孢子萌發機理研究是致病分子機理研究的重要組成部分。且已在水稻稻瘟?。?5］、大豆菌核病［16］、香蕉枯萎?。?7］等病害的研究中得到有效應用。針對孢子萌發機理的組學研究需要大量孢子作為實驗材料。因此，探索更高效的產孢方法對茄子褐紋病菌孢子萌發相關的組學研究有重要意義。【前人研究進展】羅立娟等［18-19］通過改變固體培養基配方、增加光照、降低溫度，使菌落長出分生孢子器，再通過無菌水沖洗培養皿，從中獲取孢子，此方法最快需要5～6 d。鐘彩虹等［20］在此基礎上，通過對固體培養基上的菌絲進行掃刷、無菌水沖洗、晾干等步驟將固體培養基大量產孢時間縮短到4 d。Rohini等［21］使用PDA培養基在28 ℃培養7 d產孢。Mudasir等［22］分析了30個茄褐紋病菌株的菌絲形態及顏色,并發現不同菌株在PDA培養基上25 ℃培養需要的產孢時間從5 d到30 d不等?！颈狙芯壳腥朦c】隨著生物技術的發展，利用基因組、蛋白組、代謝組等多組學為致病機制研究提供了新的技術手段，然而以上傳統產孢方法所獲孢子數量有限且無法滿足多組學分析研究的需求。【擬解決的關鍵問題】本研究以優化培養方法和提高褐紋病菌產孢數量為主要科學問題，建立了茄子褐紋病致病菌的分離鑒定和產孢條件的優化方法，為茄子抗褐紋病種質資源篩選鑒定、抗病機制及褐紋病菌致病機理研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年3—12月在廣東省蔬菜新技術重點實驗室進行。褐紋病菌株（PV5）病株取自廣東省廣州市白云區鐘落潭鎮茄子種植基地（23°23' 24.5" N，113°26' 19.4" E）。

菌株及質粒載體：TA克隆所用大腸桿菌DH5α感受態細胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，pM-18T質粒購自購自寶生物工程（大連）有限公司。

酶及有關試劑：Primer STAR 高保真PCR酶、Loading Buffer購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂粉、葡萄糖購自Sigma公司，馬鈴薯、燕麥、苜蓿桿購自當地市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 褐紋病菌株的分離純化 無菌環境下，取1×0.5 cm大小的病健交界處組織，無菌水沖洗2次后，次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗3次后，放入PDA平板28 ℃培養。

1.2.2 褐紋病菌株的分子鑒定 取培養基中菌絲約100 mg，使用CTAB法提取真菌基因組DNA。以此DNA為模板，使用真菌核糖體rDNA區通用引物ITS1：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進行PCR反應，擴增ITS1-5.8S-ITS2 rDNA全序列及部分18S和28S rDNA序列。反應體系為：模板1 μL，上下游引物各 0.5 μL，ddH2O 8 μL，PCR 酶 MIX10 μL。反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30 個循環；72 ℃ 10 min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收DNA條帶，經TA克隆后，送上海生工生物測序，將菌株ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列在NCBI網站上進行比對，下載比對結果中相似度較高序列，并使用MEGA軟件構建進化樹。

1.2.3 培養基配制 馬鈴薯葡萄糖固體培養基（Potato Dextrose Agar，PDA）的配制：去皮馬鈴薯200 g、瓊脂粉17～20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL，馬鈴薯洗凈后，稱取200 g，切成碎塊，放入鍋中加1 000 mL水煮沸30 min，雙層紗布過濾后，趁熱加17～20 g瓊脂粉和20 g葡萄糖使其充分溶解，補足水量，分裝到三角瓶并用封口膜密封，高壓濕熱滅菌（121 ℃，20 min）后冷卻備用。其他培養基方法相同，燕麥固體培養基（Oat Meal Agar，OMA）：燕麥30 g，瓊脂粉14 g，水1 000 mL。苜蓿煎汁固體培養基：苜蓿桿100 g，燕麥30 g，瓊脂粉14 g，水1 000 mL。對應的液體培養基在配方中去除瓊脂粉。

1.2.4 液體培養基產孢方法 使用PDB, 50%（10 g）葡萄糖PDB，25%（5 g）葡萄糖PDB，無糖PDB，苜蓿煎汁液體培養基，燕麥液體培養基，接種后，在28 ℃150 r/min光照12 h/d條件下培養1 d后分別放入20、22、24、26 ℃培養箱中培養。

1.2.5 孢子的顯微鏡觀察 取液體培養基100 μL在干凈載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。產孢數量通過血球計數板顯微觀察測定。

2 結果與分析

2.1 褐紋病菌的鑒定

2.1.1 形態學鑒定 從發病組織上分離得到菌株PV5，該菌株在PDA固體培養基上呈輻射狀生長，菌絲為白色絮狀。菌落整體呈同心輪紋狀，靠近菌落中心部位菌絲較密集，靠近菌落邊緣菌絲則相對稀疏（圖1 A）。生長后期菌落上產生黑色點狀分生孢子器，內含大量孢子。光學顯微鏡觀察顯示孢子呈卵圓形，寬約5～6 μm，長約10～12 μm，兩端有油胞（圖1 B）。

圖1 茄子褐紋病菌菌落及孢子形態Fig. 1 Colonies and spore morphologies of Phomopsis vexans Harter

2.1.2 分子生物學鑒定 使用PV5菌株ITS1-5.8S-ITS2 rDNA區段在NCBI網站上進行序列相似性比對，發現該菌株的ITS序列與已報道的多條茄褐紋擬莖點霉菌序列相似度達80%以上。因此可以確定菌株為擬莖點霉屬的茄褐紋病菌。使用Neighbor-Joining法對菌株以及擬莖點霉屬其他種病原菌的ITS序列構建系統發育樹，結果（圖2）顯示，PV5與Phomopsis vexans親緣關系最近。從草莓上分離的Phomopsis obscuransd單獨聚為一分支，從葡萄、櫻桃和沙梨上分離的Phomopsis viticola、Phomopsis perniciosa和Phomopsis fukushii親緣關系與PV5較近。黃瓜和楊桃上分離的Diaporthe phaseolorum和Phomopsis averrhoae與PV5親緣關系較遠。

2.2 不同培養條件對產孢數量的影響

2.2.1 培養基形態對菌絲生長的影響 經過24 h培養，PDA培養基和苜蓿煎汁+OMA培養基中菌斑直徑分別為1.5、1 cm，而OMA固體培養基中則未出現肉眼可見的菌落。液體培養基中部分菌絲由于搖床的搖動而呈小球狀，且3種液體培養基中的菌絲量遠遠大于固體培養基（圖3）。

2.2.2 充分營養生長對產孢數量的影響 茄褐紋擬莖點霉菌在液體培養條件下28 ℃培養1 d即可產生大量菌絲。一定的低溫條件能促進孢子產生，而低溫不利于菌絲生長。為了緩解這一矛盾，本試驗探索使用28℃培養1 d后再放入24 ℃培養產孢。為了證明效果，使用28 ℃培養1 d、24 ℃培養3 d的產孢量與24 ℃持續培養4 d的產孢量進行比對，結果（表1）表明，不提供充分營養生長的條件下，褐紋病菌培養3 d后才開始產孢，而提供1 d的營養生長時間，褐紋病菌培養2 d后就開始產孢并且培養4 d后的孢子數量為不提供營養生長的240倍。

圖2 基于ITS-5.8S rDNA 序列構建的遺傳進化樹Fig. 2 An evolutionary tree based on ITS-5.8S rDNA sequence of Phomopsis vexans Harter

圖3 不同形態培養基中PV5菌株菌絲生長情況Fig. 3 Growth condition of PV5 in different media

2.2.3 培養溫度對產孢數量的影響 為了探索液體培養基培養的最佳產孢溫度，設置20、22、24、26 ℃ 4個溫度梯度，經過28 ℃培養1 d后，將菌液放入相應的溫度培養3 d并通過血球計數板觀察每培養1 d后的孢子數量，結果見表2。22～26 ℃條件下菌株在培養3 d后觀察到產孢。培養4 d后觀察產孢量發現，24℃培養條件下孢子含量最高。因此可以判斷，24℃為最佳產孢培養溫度。

表1 不同培養步驟的產孢數量（個/毫升）Table 1 Spore production quantity under different culture methods（spores/mL）

2.2.4 培養基配方對產孢數量的影響 在已有的產孢相關研究中，不同培養基種類對產孢數量也有較大影響。且培養基中碳源含量也會影響產孢。針對這一情況，研究了相同培養條件下，PDB、減糖PDB培養基以及兩種較常見產孢培養基的產孢數量，結果見表3。25%葡萄糖PDB培養基和苜蓿培養基產孢效率相對較高?？紤]到培養基配制的簡便性，25%葡萄糖PDB培養基產孢效率最高。

3 討論

褐紋病是當前茄子生產上的重大病害，然而由于相關研究基礎薄弱，僅局限于病原菌的分離鑒定和抗病資源篩選等研究，且缺乏完備的產孢方法，嚴重阻礙了茄子褐紋病菌的致病機制研究和分子機理解析。微生物人工培養條件的篩選與優化是開展相關機理研究的技術基礎［23-24］。通過培養條件的優化、簡化技術流程，進而獲得致病菌孢子的富集，對于深入研究孢子發育、致病機理具有重要理論意義。前人研究發現能促進植物病原菌產孢的因素主要有營養控制、寄主組織誘導、光照、物理損傷等［25］，目前針對褐紋病菌的研究多用PDA固體培養基對病菌進行培養。Akhtar等［26］曾使用馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養基對茄子褐紋病菌進行培養，并稱量了不同菌株的重量，但并未提及產孢相關內容。本研究通過比較固體和液體培養基對菌絲生長量的影響，發現3種液體培養基（OMA培養基、PDA培養基、苜蓿煎汁+OMA）28 ℃培養1 d比固體培養基菌絲生長量增加。本研究通過6種液體培養基比較試驗發現，25%葡萄糖PDB培養基產孢效率最高；并且使用28 ℃培養1 d 24 ℃培養3 d后的產孢量是24 ℃持續液體培養4 d產孢量的240倍。因此，在促進菌絲生長后，可以根據實驗條件綜合多個因素如光照、機械損傷等以提高產孢效率。

表2 不同培養溫度的產孢數量（個/毫升）Table 2 Spore production quantity under different culture temperatures（spores/mL）

表3 不同培養基的產孢數量（個/毫升）Table 3 Spore production quantity under different culture media（spores/mL）

本研究在前人研究的基礎上，使用液體培養基培養褐紋病菌，通過低溫光照提供的逆境，以及液體培養中搖床造成的機械力打斷菌絲，綜合了多種促進產孢的因素。同時，所產生分生孢子器中的孢子直接進入培養基，獲得的孢子液過濾后可直接使用，簡化了產孢過程。為茄子褐紋病菌的基因組及轉錄組研究［27］、深入挖掘茄褐紋病菌孢子萌發相關分子機制、開展褐紋病與植株的互作研究提供理論基礎。

本研究所產生的孢子均為α型孢子，未見β型孢子。在前人的研究中，PDA固體培養基培養的褐紋病菌能產生α、β兩種孢子［13-14］，本課題組前期研究中也獲得了類似結果。但為何液體培養產孢只觀察到α型孢子，還需要進一步開展產孢機理研究。

4 結論

本研究首次嘗試使用液體培養基促進茄子褐紋病菌產孢。產孢條件的優化結果表明，液體培養基中菌絲生長多余固體培養基且可用于產孢。最佳產孢條件為：在150 r/min搖床中，使用25%葡萄糖PDB培養基，28℃培養1 d后24℃培養3 d。在此條件下培養，產孢量可達到1.2×1010個 /mL。